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类固醇激素对动物的调控包括胚后发育,变态及生殖行为等。而昆虫的蜕皮激素属于类固醇类激素,该激素其通过对一系列激素相关转录因子的调控进行信号的转导和放大,触发幼虫的蜕皮、变态,协调胚后发育以及昆虫成体的生殖。类固醇激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)作为昆虫蜕皮激素的主要活性形式,调控昆虫生命周期中各种的形态的转化,20E的转录调控是通过与两个核受体超家族成员,即蜕皮激素受体(Ecdysone receptor, EcR)和超气门蛋白(Ultraspiracle Protein, USP),形成的异源二聚体结合相互作用,起始包括转录因子表达在内的蜕皮级联反应,从而引起昆虫蜕皮,发育现象。蜕皮激素受体(EcR)是目前唯一已知昆虫配体的核受体,其结构高度保守,与蜕皮激素结合具有专一性,在昆虫的整个发育时期广泛表达。昆虫超气门蛋白(USP)作为配体激活的转录因子,通过对小的疏水分子的绑定来调节基因的表达,其隶属于核受体超家族,具有典型的核受体结构,与蜕皮激素受体(EcR)结构类似,但不具有高度不保守的F域,USP作为保幼激素的一个候选受体,但是到目前为止还没有鉴定出USP的配体。本研究实验分为两部分,一是对拟黑多刺蚁(Ployrhachis vicina Roger)超气门蛋白(USP)基因功能的研究,二是对黄脸油葫芦(Teleogryllus emma Ohmachi&Matsumura)蜕皮激素受体(EcR)基因功能的研究。一、拟黑多刺蚁超气门蛋白(USP)基因功能研究本研究以拟黑多刺蚁(Ployrhachis vicina Roger)为实验材料,探究了超气门蛋白(USP)基因在其脑部的分布及对其生长发育的调节作用,利用RNAi及荧光原位杂交技术,研究了USP基因对拟黑多刺蚁3个品级成虫生长发育的影响,探讨了拟黑多刺蚁成虫中USP基因与蜕皮激素受体(EcR)基因之间的相关性。研究结果如下：1.拟黑多刺蚁USP (PvUSP)基因组织定位与定量分析采用荧光原位杂交及实时荧光定量技术对拟黑多刺蚁USP基因在其脑部的定位及定量做了相关的研究,荧光原位杂交结果显示不同品级拟黑多刺蚁成虫脑部USP基因的分布不尽相同,但在拟黑多刺蚁不同品级成虫脑部蕈形体中都呈高表达,表明该基因参与了拟黑多刺蚁脑部神经系统功能作用的发挥。在工蚁嗅叶纤维细胞相对雌(雄)蚁高表达,由此推测,PvUSP可能参与了工蚁嗅觉信息处理能力的构建；在雌蚁中蕈形体Kenyon细胞、中央复合体、侧前脑阳性反应明显,这可能与雌蚁在蚁群中主要行使交配,产卵,繁殖后代的社会职责有关。此外,PvUSP可能与雌蚁的视觉、学习记忆和求偶等行为有关；在雄蚁视叶相对高表达,这可能与雄蚁视觉发育及交配行为有关,PvUSP可能参与雄蚁视觉神经系统的构建。而实时荧光定量检测结果也显示,PvUSP在不同品级中表达存在差异,工蚁中最高,雄蚁次之,雌蚁最少,联系到拟黑多刺蚁的品级分化及行为活动的多样性,进一步说明PvUSP对拟黑多刺蚁神经系统功能作用发挥起着重要作用。2.拟黑多刺蚁USP及EcR表达量的测定及其相关性分析采用RNAi方法将PvUSP沉默探究其对拟黑多刺蚁生长发育的影响。体外合成PvUSP dsRNA,扩增片段大小为621bp,采用双对照实验即空白对照和阴性对照(GFP dsRNA,扩增片段为328bp),以10ng/μL浓度饲喂不同品级拟黑多刺蚁,饲喂周期结束后对不同品级拟黑多刺蚁成体USP及EcR基因mRNA水平相对表达量进行测定,结果显示三个品级的拟黑多刺蚁体内USP基因的表达均降低,与对照组相比均存在极显著差异(P<0.01),说明RNA干扰实验效果明显,而相对USP表达量的下降,PvEcR的表达出现上升趋势,与对照组相比雌蚁表达量差异显著(P<0.05),对于雌蚁EcR基因转录水平上显著上调,初步推测拟黑多刺蚁USP基因与EcR基因存在互补性,当PvUSP受到抑制时PvEcR高表达,表明PvEcR对PvUSP功能的补偿作用。黄脸油葫芦蜕皮激素受体(EcR)基因功能检测及其与雌激素相关受体(ERR)基因的相关性研究本研究以黄脸油葫芦(Teleogryllus emma Ohmachi&Matsumura)四龄幼虫为实验材料,利用RNAi技术,研究了蜕皮激素受体(EcR)基因对其生长发育的影响及其与雌激素相关受体(ERR)基因的相关性,研究结果如下：采用RNAi方法,将黄脸油葫芦四龄幼虫EcR基因沉默,探究其对黄脸油葫芦生长发育的影响。体外合成TeEcR dsRNA,扩增片段555bp,设置阴性对照(GFPdsRNA,扩增片段为328bp),5ng/μL浓度注射,结果显示随着时间推移TeEcRmRNA表达水平不断降低,但TeERR mRNA mRNA表达水平变化不显著。干扰TeEcR后,雌性个体翅末端残缺,背板发育不良,说明TeEcR被沉默,蜕皮激素信号通路被阻断。由此说明TeEcR对黄脸油葫芦变态发育蜕皮,翅的发育具有调控作用。并且推测TeERR基因可能处于TeEcR基因上游,两者在功能调节上相关性不显著。