论文部分内容阅读
目的:N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物信使RNA(mRNA)中最丰富的修饰,其在各种基本的生物过程中发挥着重要作用。然而,m6A甲基化在弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用仍不清楚。本研究目的在于强调m6A甲基化修饰机制在DLBCL中的重要性,并揭示新的DLBCL基因调控机制,为DLBCL发生发展及预后的分子机制提供深刻的见解。方法:1.采用基因芯片技术筛选出预后良好的和预后不良的DLBCL患者间差异表达的piRNAs;qPCR验证芯片结果;应用单因素、多因素生存分析评价piRNA在DLBCL预后中的价值;建立NCCN-IPI预后模型和NCCN-IPI+piRNA预后模型,比较二者预后效能。2.通过转染piRNA-30473特异的拮抗剂antagomir-30473,在DLBCL细胞系中下调piRNA-30473的表达。体外实验:比较干扰组与对照组间细胞增殖率、周期分布及凋亡率的差异:体内实验:建立DLBCL小鼠皮下瘤模型,分别腹腔注射PBS或antagomir-30473,观察piRNA-30473对肿瘤生长的影响。3.在DLBCL细胞系中下调piRNA-30473的表达,通过EpiQuik m6ARNA甲基化定量检测试剂盒检测细胞整体m6A甲基化水平并通过qPCR和Western blot检测RNA甲基转移酶(METTL3,METTL14,WTAP)、RNA 去中基酶(FTO,ALKBH5)的表达量:免疫组化检测腹腔注射antagomir-30473对小鼠肿瘤组织中WTAP蛋白表达量的影响。进一步采用免疫共沉淀检测下调piRNA-30473表达对WTAP与METTL3、METTL14的结合的影响。4.免疫组化检测DLBCL患者组织WTAP蛋白的表达;采用单因素、多因素生存分析评价WTAP在DLBCL预后中的价值。5.利用RNAi在DLBCL细胞系中下调WTAP的表达,检测干扰组与对照组间细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。6.回复实验:在干扰piRNA-30473的细胞中过表达WTAP,比较对照组、干扰组、回复组间细胞增殖率、细胞周期分布的差异。7.采用RNA FISH和核质分离实验确证piRNA-30473的细胞定位;miRanda软件预测piRNA-30473与WTAP的结合;将WTAP的piRNA-30473结合区域的野生型及突变型分别构建至pmirGLO双荧光素酶报告基因载体中,运用双荧光素酶报告基因实验验证预测结果;RNA稳定性实验验证piRNA-30473对WTAP mRNA稳定性的影响。8.利用RNAi在DLBCL细胞系中下调WTAP的表达,联合甲基化RNA免疫共沉淀高通量测序技术(Methylated RNA Immunoprecipitation sequening,m6A-seq)与转录本测序技术(RNA-sequening,RNA-seq)对m6A甲基化修饰图谱和转录本表达进行综合分析;进一步采用m6A-qPCR及qPCR进行验证;并借助基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中的 DLBCL 数据,分析 WTAP 与差异基因的表达相关性,筛选WTAP的靶基因。9.采用单因素、多因素生存分析评价WTAP的靶基因HK2在DLBCL预后中的价值。10.利用RNAi在DLBCL细胞系中下调m6A结合蛋白IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3的表达,qPCR检测各干扰组与对照组的HK2表达量;运用GEO数据库中的DLBCL数据,分析m6A结合蛋白与HK2的表达相关性;应用RNA稳定性实验检测IGF2BP2对HK2的半衰期的影响;将HK2的IGF2BP2结合区域的野生型及突变型分别构建至pGL3-Basic荧光素酶报告基因载体中,验证HK2与IGF2BP2是否结合。结果:1.piRNA-30473在预后不良病人中的表达量显著高于预后良好组,生存分析提示piRNA-30473可作为DLBCL的独立预后因子,有助于提高DLBCL预后模型的效能。2.在DLBCL细胞系中下调piRNA-30473的表达,细胞增殖减慢,细胞周期阻滞于G1期,G2期、S期细胞减少,但对细胞凋亡无影响。在体内实验中,腹腔注射antagomir-30473,显著抑制小鼠DLBCL皮下瘤生长。3.在DLBCL细胞系中下调piRNA-30473的表达,细胞整体甲基化水平下降。并且,RNA甲基转移酶WTAP的mRNA、蛋白水平下调,而其他甲基转移酶和RNA脱甲基酶(METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5)的表达量无显著变化。免疫组化发现,与对照组相比,接受antagomir-30473治疗的DLBCL小鼠的肿瘤组织中,WTAP表达降低。免疫共沉淀结果显示下调piRNA-30473的表达,与WTAP结合的m6A甲基化转移酶METTL3、METTL14减少。4.免疫组化发现,WTAP在预后不良的DLBCL患者组织中高表达。生存分析表明WTAP可作为弥漫大B的独立预后因子。5.在DLBCL细胞系中下调WTAP的表达,细胞增殖减慢、细胞周期显著阻滞于G1期及G2期,S期细胞所占比例明显减少,但对细胞凋亡无影响。6.在下调piRNA-30473表达的细胞中回复WTAP的表达,细胞增殖抑制及细胞周期阻滞被缓解。7.RNA FISH和核质分离实验表明piRNA-30473在细胞核和细胞质中均有表达:miRanda预测提示WTAP的3’端非翻译区上存在piRNA-30473的潜在结合位点;双荧光素酶报告基因实验证明piRNA-30473 可结合在WTAP的3’ UTR上;RNA稳定性实验表明干扰piRNA-30473,WTAP mRNA的稳定性降低。8.m6A-seq及RNA-seq提示,下调WTAP的表达,HK2的m6A甲基化水平及表达水平随之降低;m6A-qPCR及qPCR验证实验表明干扰WTAP,HK2 m6A甲基化水平与表达量均降低:相关性分析确证WTAP与HK2的表达存在显著的正相关性。9.生存分析提示,HK2可作为弥漫大B的独立预后因子,并有助于提高NCCN-IPI模型的预后效能。10.在DLBCL细胞系中下调m6A结合蛋白(IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3)的表达,qPCR结果表明,IGF2BP2表达下调时,HK2的表达量随之降低,而IGF2BP1、IGF2BP3的表达量下调对HK2无显著影响;同时,相关性分析确证IGF2BP2与HK2的表达存在显著的正相关性;RNA稳定性实验确证,IGF2BP2表达下调时,HK2 mRNA半衰期变短;双荧光素酶报告基因实验证明IGF2BP2可与HK2结合。结论:1.piRNA-30473通过靶向WTAP,调控DLBCL的m6A甲基化修饰。2.DLBCL中m6A甲基化失衡增强了癌基因HK2的表达,促进了 DLBCL的发展。3.piRNA-30473可作为DLBCL分层诊断,预后评估和治疗靶点。