论文部分内容阅读
研究目的补中益气汤出自李东垣的《内外伤辨惑论》,是临床上常用于脾胃气虚,清阳下陷等证,为补中益气、升阳举陷的代表方。白术是补中益气汤主要组成药物之一,白术内酯Ⅰ(AtractylenolideⅠ)是白术健脾的主要有效成分之一,以往研究发现补中益气汤及白术内酯Ⅰ对脾虚泄泻患者和(或)动物的消化、吸收等功能有着促进作用。本实验拟通过建立脾虚泄泻大鼠模型及Caco-2细胞模型,探讨脾虚泄泻大鼠小肠葡萄糖吸收障碍及SGLT1/NHE3通路的变化,并观察补中益气汤、白术内酯Ⅰ对其的干预作用,以期从分子水平阐明补中益气汤治疗脾虚泄泻的作用机制。研究方法实验研究以"大黄+利血平+控制饮食"多因素法建立脾虚泄泻大鼠模型,随机分组为正常对照组、脾虚泄泻模型组和补中益气汤低、中、高剂量组,观察大鼠造模及给药后一般情况变化、泄泻指数、D-木糖排泄率及小肠葡萄糖吸收含量,HE染色观察大鼠小肠黏膜病理学改变,westernblot法检测钠依赖性葡萄糖转运体(SGLT1)、葡萄糖转运体 2(GLUT2)、钠氢交换体 3(NHE3)、P38MAPK、P-P38MAPK、MAPKAPK2、P-MAPKAPK2、Akt2、P-Akt2、Ezrin、P-Ezrin蛋白的表达,荧光定量RT-PCR检测钠依赖性葡萄糖转运体(SGLT1)、葡萄糖转运体2(GLUT2)、钠氢交换体3(NHE3)mRNA的表达。白术内酯Ⅰ对SGLT1/NHE3及MLCK/MLC通路的影响:采用Caco-2细胞模型,用根皮苷(PZ,Phlorizin)、SB203580、NSC668394 分别阻断 SGLT1、P38MAPK、Ezrin后,再加入白术内酯Ⅰ进行干预,观察其对NHE3和(或)MLCK、P-MLC磷酸化的影响。研究结果1.大鼠体重变化及尿D-木糖排泄率:造模前,正常对照组与造模组体质量及尿D-木糖排泄率无明显差异(P>0.05),造模结束后,造模组的体重及尿D-木糖排泄率明显下降,与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01)。给予补中益气汤治疗后,给药组体重尿D-木糖排泄率均有所增加,但体重变化各组之间差异无统计学意义(P>0.05);尿D-木糖排泄率以补中益气汤高剂量组改善最为明显,与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。2.大鼠腹泻指数及小肠葡萄糖吸收量:造模后,大鼠腹泻指数升高,葡萄糖吸收量下降(P<0.05)。给与补中益气汤后,各给药组腹泻症状均逐渐减轻,腹泻指数降低,小肠葡萄糖吸收量有所提高,且呈剂量依赖性,其中以补中益气汤中剂量或高剂量组较为明显(P<0.05或P<0.01)。3.小肠粘膜病理学及Na+-K+ATP酶活性的改变:模型组大鼠小肠绒毛形态部分损伤,上皮细胞缺失,间质炎症细胞浸润,小肠绒毛的高度及宽度均明显降低(P<0.01),且小肠粘膜Na-K+ATP酶活性下降(P<0.01)。经补中益气汤干预后小肠粘膜修复明显,绒毛的高度及宽度均可见升高(p<0.01),小肠粘膜Na+-K+ATP酶活性增强,且呈剂量依赖性,其中以补中益气中、高剂量组疗效较好(P<0.01)。4.补中益气汤对脾虚泄泻大鼠SHLT1/NHE3通路相关蛋白及基因表达的影响:模型组大鼠小肠黏膜中SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白表达量降低(P<0.01或P<0.05),P38MAPK/Ezrin通路相关蛋白P38MAPK、MAPKAPK2、Akt2、Ezrin的表达量在各组之间无明显变化(P>0.05),但 P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin 蛋白表达量较正常组减低(P<0.01),给予补中益气汤后,SGLT1、GLUT2、NHE3mRNA及蛋白,P-P38MAPK、P-MAPKAPK2、P-Akt2、P-Ezrin蛋白表达量均有所提高(P<0.05),且以高剂量组最为明显。5.白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞SHLT1/NHE3通路相关蛋白表达的影响:在使用PZ抑制 SGLT1 后,Caco2 细胞 SGLT1、NHE3mRNA 和蛋白表达下调(P<0.05),P38MAPK/EZRIN通路磷酸化减少,白术内酯Ⅰ可使SGLT1和NHE3mRNA和蛋白表达增加(P<0.05),且能使SGLT1通路下游蛋白P38MAPK、MAPKAPK、Akt2、Ezrin磷酸化增加(P<0.01或P<0.05),加入 SB203580 或 NSC668394 阻断 P38MAPK 或 Ezrin 蛋白后,NHE3mRNA 及蛋白表达下调(P<0.05),给予白术内酯Ⅰ后NHE3表达增加(P<0.01),说明白术内酯Ⅰ可能不是通过P38MAPK、Ezrin来促进NHE3的表达。6.白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞MLCK/MLC通路相关蛋白表达的影响:在使用PZ抑制SGLT1后,Caco2细胞MLCKmRNA及蛋白表达减少,MLC磷酸化降低(P<0.01或P<0.05),给予白术内酯Ⅰ后MLCK表达及MLC磷酸化增加(P<0.05),说明白术内酯Ⅰ可通过促进SGLT1的表达上调MLCK表达及MLC磷酸化,加入SB203580阻断P38MAPK后,MLCKmRNA及蛋白表达减少,MLC磷酸化降低(P<0.05),给予白术内酯Ⅰ后MLCK表达增加(P<0.01),说明白术内酯Ⅰ可能不是通过P38MAPK来促进MLCK表达及MLC磷酸化增加。研究结论1.脾虚泄泻大鼠体质量及D-木糖排泄率、葡萄糖吸收率较对照组下降,腹泻指数升高,小肠绒毛损伤及Na+-K+ATP酶的活性的降低。补中益气汤可以改善脾虚泄泻大鼠腹泻症状,增加脾虚大鼠的体质量、D-木糖排泄率及葡萄糖吸收量,促进脾虚泄泻大鼠小肠粘膜损伤的修复及肠粘膜Na+-K+ATP酶的活性。2.脾虚泄泻大鼠SGLT1和GLUT2、NHE3蛋白和mRNA的表达下调,P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低,补中益气汤能通过提高SGLT1蛋白的表达,增加P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化,促进NHE3蛋白表达增加,这可能是补中益气汤治疗脾虚泄泻的机理之一。3.在Caco-2细胞中,使用根皮苷(PZ,Phlorizin)抑制SGLT1后出现SGLT1、NHE3mRNA及蛋白表达下调,P38MAPK/Ezrin通路中蛋白的磷酸化降低,抑制P38MAPK及Ezrin可出现NHE3mRNA及蛋白表达的降低,白术内酯Ⅰ可促进SGLT1的表达,进而促进P38MAPK/Ezrin通路的磷酸化,增加NHE3的表达。4.在Caco-2细胞中,抑制SGLT1或P38MAPK出现MLCKmRNA和蛋白表达下调,MLC磷酸化降低,白术内酯Ⅰ可通过增加SGLT1表达促进MLCK的表达及MLC的磷酸化。