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论文Ⅰ动眼神经损伤和电刺激动物模型的构建背景颅脑损伤、颅底和眶内肿瘤手术常造成动眼神经损伤,导致眼球运动和瞳孔括约肌功能障碍,严重影响病人的生活质量。目前尚缺乏有效动眼神经修复方法,因此研究动眼神经损伤后神经再生和功能修复机制可为最终成功修复动眼神经及其他颅神经损伤提供理论与技术支持。一些学者已应用各种动物模型研究动眼神经再生机制,并证明动眼神经损伤修复后存在解剖学上再生和功能恢复。然而在这些研究中均未详细描述颅内段动眼神经和眼外肌手术入路、应用解剖以及动物模型建立方法,而且目前实验和临床研究应用的神经电刺激和肌电图记录方法并不适合于长期和动态颅神经再生电生理学研究。尽管从伦理、经济和实用观点看,小动物常被用于颅神经再生研究,然而由于受到手术野局限,很难实施复杂颅内和眼部手术,在这种情况下自然考虑应用较大动物进行实验研究。作为研究动眼神经损伤后再生和电刺激对神经再生作用的基础工作,我们构建了安全、实用的犬动眼神经损伤和电刺激模型,进一步研究了正常犬动眼神经功能、组织学和下斜肌电生理学基本特征。目的(1)构建犬动眼神经损伤和电刺激模型。(2)研究正常犬动眼神经功能、组织学和下斜肌电生理学特征。方法1.动物模型构建42只健康成年雄性Beagle犬购自上海交通大学农学院,在全身麻醉和无菌条件下,经右侧额颞入路显微手术解剖、显露动眼神经海绵窦后段,研究手术入路和应用解剖,植入自制动眼神经刺激银丝电极;用枪状镊完全夹闭压榨动眼神经30秒,使所有轴突断裂但保留神经鞘膜完整作为神经再生通道。经结膜入路,显微手术显露右眼下斜肌、植入自制肌电图记录银丝电极。12只犬行右侧动眼神经损伤,15只动眼神经损伤和下斜肌电极植入,15只动眼神经损伤、神经刺激电极和下斜肌电极植入。加强围手术期处理,降低动物死亡率、减少术后并发症。2.动物模型评估临床检查动物术后一般情况、精神状态、手术切口和神经系统功能。检测瞳孔括约肌和眼外肌功能,评估动眼神经损伤效果。用组织学方法评估神经压榨损伤完整性。术后每天检查动眼神经和下斜肌植入电极的完整性、稳定性和安全性;用电生理学方法评估植入电极的有效性和可靠性。3.动眼神经组织学检查动物灌注原位固定后取全部海绵窦后段动眼神经干,标本在含1%戊二醛和4%甲醛的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中固定4小时后,(1)脱水,石蜡包埋,5μm厚切片,进行HE和髓鞘染色并光学显微镜分析;或(2)漂洗过夜,在含1%四氧化锇的0.1M磷酸缓冲液(pH7.4)中固定30min,脱水,植入Epon812,半薄和超薄切片,分别进行甲苯胺兰染色和乙酸双氧铀与枸橼酸铅双染并应用光学显微镜和透射电子显微镜分析。用Axioplan-2图像分析系统进行图像分析。4.动眼神经电刺激和下斜肌电生理学检查用Powerlab系统刺激动眼神经并记录下斜肌肌电图。近侧神经刺激电极连接刺激器正极,远侧电极连接负极;接地电极连接于动物口唇。刺激脉冲频率为5Hz、时程0.1ms、强度0.5～1.8volt;肌电图记录带通20Hz～10kHz。动眼神经刺激时记录下斜肌复合肌肉动作电位(CMAPs)。动物清醒状态下记录下斜肌电活动;应用声/光刺激诱导眼球运动并记录运动单位电位(MUPs)。储存并用系统配置的软件包离线分析肌电图资料。5.统计学分析计量资料以均数±标准差表示。用SPSS16.0 for Windows软件进行统计分析。两组均数间比较采用独立样本双尾t检验。结果1.动物一般情况用以上手术方法充分显露动眼神经海绵窦后段和下斜肌,安全、可靠地植入动眼神经刺激电极和下斜肌肌电图记录电极;可通过各种方式进行神经干预。所有动物术后生存和手术切口愈合良好,无颅内和眼部感染以及手术并发的角膜溃疡,死亡率为0%。除实验性神经损伤引起的动眼神经完全麻痹外,无偏瘫、癫痫等神经功能障碍并发症。2.模型评估正常犬瞳孔直径3.92±0.80mm,对光反射灵敏,瞳孔中心至外眦内侧缘距离(Dpc)和睑裂大小(PFS)分别为9.97±1.11mm和10.91±1.37mm,眼球运动灵活。所有动眼神经压榨损伤动物术后立即出现术侧动眼神经完全麻痹表现。神经组织学检查显示,动眼神经损伤处所有轴突均被切断但神经鞘膜保持完整。实验期间所有植入电极均稳定、有效工作,无扭曲、折断和脱出,没有引起颅内和/或眶内感染和动眼神经副损伤。3.动眼神经组织学特征健康成年犬动眼神经从出中脑处至进入眼外肌长1.96±0.15cm,由10,282.00±1,195.66根神经纤维组成;有髓神经纤维8,875.00±1,088.72根、占神经纤维总数的86.32±0.55%,平均直径10.61±0.72μm,轴突平均直径6.46±0.41μm,平均髓鞘厚度2.08±0.27μm;无髓神经纤维1407.00±108.22根、占神经纤维总数的13.68±0.55%,平均直径0.45±0.23μm。4.下斜肌电生理学特征清醒健康犬眼球处于休息位,下斜肌无正常和/或异常自发电活动;声/光诱导眼球运动时,正常运动单位电位(MUPs)波形一致,2～4位相,时程3.16±0.15ms,波幅524.18±133.89μvolt,募集相正常,无多相波。神经超强刺激(1.8 volt)时,复合肌肉动作电位(CMAPs)潜伏期2.91±0.03ms、波幅526.67±15.891μvolt、时程4.28±0.21ms。结论(1)应用该颅部和眼部手术方法对犬颅内段动眼神经损伤干预、植入神经刺激电极并在下斜肌植入肌电图记录电极,动物存活率高,无明显并发症,成功建立动眼神经损伤和电刺激动物模型。该动物模型安全、稳定、可靠,适用于动眼神经损伤后多方面神经再生和电生理学动态研究。(2)初步确定正常犬动眼神经功能和下斜肌电生理学基本特征参数,验证动眼神经组织学特征,为研究动眼神经损伤后神经再生和功能恢复奠定基础。