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研究背景据全球癌症发病的最新统计资料显示肺癌为当今世界第一高发癌,在发展中国家,中国男性肺癌属高发人群,而女性肺癌与澳洲、新西兰一样,属于世界范围内中等发病率的人群。近年来肺癌在我国发病率呈明显上升趋势。小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）发病率占原发性肺癌的10%～25%,肿瘤的分化程度很低,较早发生血行转移,预后极差。虽然SCLC对化疗敏感,但很快即可发生多药耐药（multidrug resistance,MDR）现象而导致化疗失败。MDR指肿瘤一旦对某种化疗药物产生耐药性,就同时对其他结构上无关、作用机理各异的药物也产生交叉耐药性,是一种特殊的广谱耐药现象。小细胞肺癌患者对目前临床应用的化疗药物反应敏感,但由于极易出现耐药性,化疗效果常常不理想,以致小细胞肺癌的复发率很高,临床预后差,一般2年存活率不足5%,90%的患者多在确诊后5年内死亡。因此,化疗抗药性已成为近年来小细胞肺癌临床治疗急需解决的问题之一。研究发现癌细胞逃避化疗药物诱导的细胞凋亡是化疗抗药性产生的决定性因素。因此,研究癌细胞逃避凋亡的机制成为阐明化疗抗药性的关键。细胞能否发生凋亡由抑癌细胞凋亡和促癌细胞凋亡基因间的平衡控制,化疗药物能诱导癌细胞凋亡,而一旦某种或多种凋亡抑制基因过表达或促凋亡基因受到抑制,细胞就不会发生凋亡,癌细胞逃避化疗药物诱导而出现耐药性。在众多凋亡相关基因中,Bcl-2家族与肿瘤化疗抗药性密切相关。大多数Bcl-2家族成员都是细胞线粒体凋亡的调节器。根据功能不同可分为三类:a:抗凋亡基因:包括Bcl-2、Bcl-xL,b:促凋亡基因Bak、Bax,c:抗凋亡和促凋亡双向调节基因Bid,Bik,Noxa,及Bim。本研究只针对其中抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡基因Bak、Bax进行研究。Bcl-2和Bcl-xL是目前发现的可能与小细胞肺癌化疗抗药性关系密切的凋亡抑制基因,在抵御外界凋亡诱导刺激中起着直接的作用。Bax是Oltvai等人于1993年用免疫沉淀等方法,从人和鼠B细胞中发现的一种能与Bcl-2共沉淀的蛋白质,具有促细胞凋亡的特性,而且与肿瘤的发生发展、肿瘤细胞的多药耐药现象密切相关。Bak（for bcl-2 homologus antagonist/killer）是1995年Chittenden,Farrow及Klefer等各自独立地克隆了Bcl-2家族中的一个新基因,其表达能加速细胞凋亡。尽管Bcl-2家族凋亡相关基因在细胞凋亡调控中的作用机制研究已经取得重大进展,但其上游基因的调控通路尚不清楚,已有研究表明酪氨酸激酶在细胞凋亡的调控通路中可能起到重要作用。酪氨酸激酶分为受体类和非受体类两大类,Btk家族是近年来研究较多的与T、B淋巴细胞增殖分化关系密切的一大类非受体类酪氨酸激酶。上皮和内皮细胞酪氨酸激酶（epithelial and endothelial tyrosine kinase,Etk）,又名骨髓X激酶（bone marrow X kinase,Bmx）,是Btk家族（Btk/AKT,ITK/EMT/TSK,Txk,TEC及Etk/BMX）中的重要成员之一。Etk激酶是Btk家族中唯一除分布于淋巴造血细胞外,还在上皮细胞和血管内皮细胞中表达的非受体类酪氨酸激酶。尽管Etk在上皮细胞中的表达水平不高,但研究发现它在上皮增殖、分化、凋亡和肿瘤发生过程中起着重要调控作用:Qiu证实Etk参与了IL-6介导的前列腺癌细胞的分化。Guo等通过免疫组织化学技术发现Etk有可能在部分病例中参与了鼻咽黏膜上皮分化的调节。我们前期的研究发现酪氨酸激酶Etk在小细胞肺癌组织中的阳性表达率明显高于肺鳞癌和肺腺癌,Etk表达与凋亡相关基因Bcl-2等有明显相关性,为进一步探讨Etk与小细胞肺癌细胞凋亡的关系,我们用阿霉素处理小细胞肺癌NCI-H446细胞和Etk高表达细胞株NCI-H446 WT两种细胞,结果表明Etk对阿霉素诱导的细胞凋亡有抵抗作用。基于酪氨酸激酶Etk在小细胞肺癌细胞凋亡调控中的作用,本实验通过细胞和分子生物学实验,进一步研究Etk在小细胞肺癌细胞和耐药细胞株中表达情况及与凋亡相关蛋白Bcl-2家族之间的关系,探讨Etk在小细胞肺癌细胞耐药性产生中的作用,为临床解决小细胞肺癌治疗中极易出现的耐药性问题提供新的理论依据。目的:1:本实验选择小细胞肺癌细胞株H69与其阿霉素耐药细胞株H69AR作为研究对象,分析两株细胞形态学、细胞周期和对化疗药物敏感性的差异。2:分析小细胞肺癌细胞株H69与其阿霉素耐药细胞株H69AR在mRNA和蛋白水平二者Etk表达的差异,运用RNAi技术将高表达Etk的H69AR细胞株中的Etk进行沉默后,检测沉默效果,观察H69AR细胞株耐药性的变化。3:分析小细胞肺癌细胞株H69与其阿霉素耐药细胞株H69AR两细胞株中Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、BcI-xL、Bak及Bax）表达的差异以及Etk蛋白与Bcl-2家族蛋白表达的关系。方法:1:光学显微镜下观察小细胞肺癌细胞株H69与其阿霉素耐药细胞株H69AR二者形态学及细胞周期的差异;2:应用CCK8法检测小细胞肺癌细胞株H69与其阿霉素耐药细胞株H69AR二者耐药指数的差异,验证H69AR对阿霉素耐药性和其他化疗药物的交叉耐药性;3:实时定量PCR、流式细胞术和Western blot技术分析两细胞株中Etk和磷酸化Etk（P-Etk）表达的差异;4:经实时定量PCR、流式细胞术和Western blot技术证实H69AR细胞中Etk表达水平明显高于H69细胞后,运用脂质体Lipofectamine2000法将EtksiRNA转染进入H69AR细胞,进行Etk基因沉默,运用流式细胞术和Western blot技术检测基因沉默效果;5:CCK8法检测Etk沉默后的H69AR细胞耐药性的变化;6:流式细胞术及Western blot技术检测小细胞肺癌细胞株H69和耐药细胞株H69AR中Bcl-2、Bcl-xL、Bak及Bax蛋白表达的变化;7:免疫共沉淀（IP）技术检测Bcl-2家族中Bcl-xL蛋白与Etk蛋白的关系;8:统计学分析:统计分析软件为SPSS13.0版。细胞周期分析、蛋白含量测定、灰度值分析结果均重复三次（n=3）,数据以均数±标准差（（?）±s）表示,具体统计方法采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,P<0.05有显著性差异。蛋白浓度标准曲线和细胞生存率曲线均由Excel作图得到。结果1:相对于亲代H69细胞,H69AR细胞的生长速度减慢,细胞周期分布G0/G1增加,由51.07±1.69增加至68.24±1.74（%）,G2/M减少,由17.4±1.08减少至2.98±1.1,有显著性差异（P<0.05）;2:CCK8法耐药谱分析显示该H69AR细胞株对阿霉素的耐药倍数为63.88,此外,该细胞系对其它化疗药物如紫三醇也有交叉耐药,耐药系数为5.626;3:相对于亲代H69细胞,经实时定量PCR检测,在mRNA水平H69AR细胞中Etk水平显著增高,由8.426x10-6增加至5.514×10-5;在蛋白水平H69AR细胞中Etk水平也显著增高:流式细胞术结果显示Etk蛋白由46±4.4增加至92.83±2.8,Western blot灰度值分析结果显示Etk蛋白由0.56±0.014增加至0.994±0.038,有显著性差异（p<0.05）;4:通过基因沉默技术成功地降低H69AR细胞株中Etk含量,经流式细胞术及Western blot检测显示Etk沉默后的H69AR细胞中Etk水平明显降低,流式结果显示Etk水平由77.7±2.9降至6.9±1.8,Western blot灰度值显示Etk水平由0.4457±0.005降至0.2925±0.0038,有显著性差异（p<0.05）;5:CCK8结果显示,Etk沉默后的H69AR细胞对阿霉素的耐药性明显降低,耐药指数由63.88降至7.26;6:相对于亲代H69细胞,流式细胞术结果显示,H69AR细胞中Bcl-2（由86.6±0.83增加至93.3±1.93）和Bcl-xL（由28.1±1.32增加至45.7±1.4）表达显著增高,而Bak（由28.6±0.96降低至9.7±0.42）和Bax（由19.8±0.78降低至9.7±0.42）的表达水平显著降低,有显著性差异（P<0.05）;Western blot灰度值结果显示,H69AR细胞中Bcl-2（由0.736±0.02增加至0.907）和Bcl-xL（由0.571±0.007增加至0.714±0.009）表达显著增高,而Bak（由0.427±0.005降低至0.264±0.009）和Bax（由0.306±0.009降低至0.214±0.007）表达水平显著降低,有显著性差异（P<0.05）;7:根据IP结果显示,Etk蛋白和Bcl-2中Bcl-xL蛋白是相互作用的蛋白质,并且进一步验证了相对于亲代H69细胞,H69AR细胞中Bcl-xL蛋白和Etk蛋白显著增高。结论:1:人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR具有多药耐药性;2:相对于小细胞肺癌细胞株H69,小细胞肺癌阿霉素耐药细胞株H69AR中Etk水平显著增高,基因沉默技术降低H69AR中Etk水平后,H69AR对阿霉素的敏感性显著增加,进一步证实了Etk有抵抗化疗药物诱导细胞凋亡的作用,并且在小细胞肺癌耐药性产生过程中可能起到重要的作用;3:人小细胞肺癌耐药细胞株H69AR耐药性的产生可能与Etk水平增高、Bcl-2家族中Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达增高及Bak和Bax蛋白表达降低有关,经免疫共沉淀实验得出:Etk与Bcl-2家族中Bcl-xL蛋白是相互作用的蛋白质,二者在人小细胞肺癌耐药性的产生中可能起到重要的作用。