近年来，肿瘤干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）假说在相关领域掀起了巨大的骚动，此学说认为：肿瘤是由其自身的干细胞所维持的。这群细胞或者处于休眠状态或者不断的分裂出肿瘤细胞导致肿瘤的发生、发展，也参与了肿瘤耐药、复发和转移的机制。进一步的了解CSCs的特点将有助于早期预防肿瘤发生和增加肿瘤治疗方法的选择性。近几年从多种肿瘤中成功的分离出CSCs，比如乳腺癌、前列腺癌、脑癌和结肠癌等等，尽管如此，干细胞的存在与否仍然是个备受争议的话题。肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)是一种高度恶性肿瘤，因其转移早，预后差，如何治疗HCC是医学界的一大世界性难题。肝癌干细胞（Hepatic cancer stem cells, HCSCs）是体外研究治疗策略的非常好的模型，正是如此，HCSCs的分离与鉴别是至关重要的，只有获得了纯正的HCSCs，后续的研究才有可信度。目前常用的分选HCSCs的方式种类繁多，主要是针对其表面分子标志物的识别如CD133和EpCAM，应用荧光活化细胞分选系统（Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS）及磁性活化细胞分选系统（Magnetic-activated Cell Sorting, MACS）来分选，然而，分选HCSCs的标志物特异性是有争议的。为了弥补这个缺憾，有不少学者尝试利用干细胞能够将荧光染料Hoechst33342或者罗丹明123外排的特性，通过FACS筛选出边缘群（Side Population, SP）细胞的方法富集HCSCs，此方法非常有效，但是最近的研究表明，染料Hoechst33342可损伤细胞以致影响实验的准确性，以及SP细胞的假阳性，这些都限制了该方法的广泛应用。因此我们选择了另外一种方法，即密度梯度离心。根据前期我实验室建立的分离胎肝干/祖细胞(Fetal Liver Stem/Progenitor Cells, FLSPCs)的三步分离法，我们以改进的设计进行大鼠HCSCs的分离。研究目的：基于HCSCs的物理特性，使用Percoll连续密度梯度离心方法富集HCSCs，并通过细胞形态学、功能学等方法检测其是否具有干性，最后以非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠（Non-Obese Diabetic mice with SevereCombined Immunodeficiency Disease, NOD/SCID mice）成瘤实验来验证所分选细胞的致瘤能力。研究方法：F334大鼠行二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine, DENA）腹腔注射建立肝癌模型，确认成癌后提取原代肝癌细胞并体外培养，经过差速消化法初步纯化细胞，扩增至足量后行Percoll连续密度梯度离心，根据密度指示珠标识将细胞分为四层并继续培养。首先将所分选细胞分别行透射电镜、鬼笔环肽染色观察细胞的形态，并做AFP和CK-19免疫荧光染色确定细胞来源。其次通过流式细胞术和荧光实时定量检测各层细胞的CSCs标记水平。继而通过绘制生长曲线、Transwell实验检验各层细胞的增殖、迁移和侵袭能力，最后行NOD/SCID小鼠成瘤实验检测细胞的致瘤能力。研究结果：Percoll离心所得四层细胞，由AFP和CK-19免疫荧光染色可知均为肝细胞性肝癌来源；透射电镜、鬼笔环肽染色发现第3层细胞有干细胞的形态表现，且纤毛和伪足较多；生长曲线、侵袭实验均可见第3层细胞具有最强的增殖、迁移和侵袭能力；流式细胞术得出第3层细胞EpCAM与AFP阳性表达最高，分别为（84.5±8.31）%和（85.2±8.31）%；Realtime-PCR证实，第3层细胞的EpCAM和AFP的mRNA表达最高，分别为（111.34±5.59）和（13.76±0.95），第3层的CD133表达为（17.16±0.42），与第2层、4层差异有统计学意义，但与第1层差异无统计学意义；NOD/SCID小鼠成瘤实验显示，1×104个/ml浓度的第3层细胞成瘤率为100%，且成瘤最早、体积最大，移植瘤镜下显示为肿瘤细胞且来源为肝细胞性肝癌，同时观察到肝脏也受到了不同程度的侵害，充分说明了此层细胞的致瘤能力强，并可能归巢性的损伤了肝脏。研究结论及意义：利用Percoll连续密度梯度离心从原代培养的大鼠肝癌细胞中分离出的第3层细胞，形态学上与CSCs相似，功能学中增殖、侵袭和致瘤能力均强于其他层肿瘤细胞，经过证实，此层细胞就是我们所需要的HCSCs。该实验方法与表面标志分选相比，虽然精度稍差，但是方法简单，价格低廉，富集细胞量丰富，完全不受标志分选因无特异性标志物所致的限制，是一个富集HCSCs的很好的方法，作者相信此方法能为生物科学两个领域作出贡献，即肿瘤干细胞分选及肝癌治疗。