论文部分内容阅读
持续性的房颤可导致心房电重构及纤维化,目前的研究显示,这是一个非常复杂的病理生理过程,许多因素参与其中,包括氧化应激、表观遗传调控、钙超载、心房扩张、炎症以及心肌肌成纤维细胞的活化等。心肌纤维化对房颤的产生及发展起到关键的作用,心肌中细胞外基质的过度沉积,是房颤重要的病理特征。环形非编码RNA（Circular RNA,circRNA）是一种闭合环状的非编码RNA,是一种重要的表观遗传调控方式,参与多种心血管疾病的发生发展过程。本文研究circRNA100395在房颤病人心耳中的表达,及其对心肌纤维化的调控作用。目的:探究circRNA100395对心肌纤维化的调控作用及可能分子机制。方法:1、Western-blot和Masson染色检测长程持续性房颤患者左心耳心肌组织纤维化程度;2、CircRNA表达谱芯片检测房颤患者左心耳组织中circRNA的差异表达,RT-qPCR验证circRNA100395表达并鉴定核质分布;3、原代分离人心房肌成纤维细胞（HAFs）,并通过免疫荧光法检测HAFs中ACTA2的表达;4、血管紧张素II（Ang-II）诱导HAFs纤维化,RT-qPCR和Western-blot检测纤维化相关基因、circRNA100395及其宿主基因KLHL20的表达;5、重组腺病毒介导HAFs上调表达circRNA100395,CCK-8和Transwell实验检测circRNA100395对HAFs的增殖和迁移能力的影响,RT-qPCR和Western-blot检测circRNA100395对纤维化相关基因表达的影响;6、生物信息学预测与circRNA100395存在结合作用的微小RNA（microRNA）;7、HAFs中过表达circRNA100395,RT-qPCR检测miR-144-3p的表达情况;8、双荧光素酶报告基因实验、RNA反义纯化技术（RAP）和RNA pull-down实验检测circRNA100395与miR-144-3p的结合作用;9、RT-qPCR和Western-blot检测转染miR-144-3p后,HAFs中纤维化相关基因的表达情况;10、HAFs中过表达circRNA100395与miR-144-3p后,Western-blot检测纤维化相关基因表达情况及Smad3信号通路的激活情况。结果:1、长程持续性房颤患者左心耳心肌组织纤维化程度明显增加;2、在房颤患者左心耳组织中circRNA100395表达明显降低,且主要分布于细胞质内;3、从房颤患者左心耳组织分离培养的HAFs为表达ACTA2表型的心肌成纤维细胞,适合用于纤维化表型相关的研究;4、Ang-II诱导的HAFs纤维化细胞模型中,纤维化相关基因表达上调,circRNA100395及宿主基因KLHL20表达显著上调;5、过表达circRNA100395后,HAFs增殖和迁移能力降低,纤维化相关基因表达减少;6、生物信息学预测CircRNA100395与miR-144-3p存在潜在的结合作用;双荧光素酶报告基因实验、RAP和RNA pull-down实验证实CircRNA100395与miR-144-3p存在结合作用;7、HAFs过表达miR-144-3p后,纤维化相关基因表达上调,Smad3通路激活,而circRNA100395可抑制miR-144-3p的致纤维化作用。结论:1、CircRNA100395在长程持续性房颤患者左心耳心肌组织中表达明显下调;2、CircRNA100395可抑制HAFs中纤维化相关基因的表达,降低HAFs的增殖及迁移能力;3、CircRNA100395可与miR-144-3p相互结合;4、MiR-144-3p具有促心肌纤维化的作用,circRNA100395抑制人心房肌成纤维细胞纤维化相关基因表达的调控作用。