食品中生物胺与杂环胺高通量荧光免疫检测方法研究

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本文以生物胺(Biogenic amines,BAs)和杂环胺(Heterocyclic aromatic amines,HAAs)为研究对象,建立五种新型荧光免疫检测方法。分别以单色Na YF4Yb/Tm,双色Na YF4Yb/Tm与Na YF4Yb/Er,三色Na YF4Yb/Tm、Na YF4Yb/Er与Na YF4Yb/Er/Mn上转换纳米材料(Up-conversion nanomaterials,UCNPs)为荧光检测信号,通过磁分离作为信号源分离手段,建立了单独检测酪胺、同时检测酪胺与组胺以及同时检测酪胺、组胺与章鱼胺的三种荧光免疫检测方法,成功应用于肉及其制品、水产品和发酵产品中BAs的检测。基于单双寡核苷酸链信号放大技术,以广谱特异性抗体为识别元件,建立两种同时检测八种HAAs总含量的荧光免疫检测方法,并应用于油炸、烧烤等热加工肉制品中八种杂HAAs总含量的检测。(1)成功制备在483 nm处有单一特征发射峰的发蓝色荧光的羧基修饰的Na YF4Yb/Tm UCNPs,将其与酪胺抗体偶联制备荧光免疫信号探针,建立酪胺荧光免疫检测方法。在检测体系中,酪胺分子与捕获探针表面的酪胺包被原竞争结合信号探针表面上的抗体,在外界磁力作用下,信号探针与捕获探针偶联物被快速分离。在980nm激发下,测定信号探针与感应探针的偶联物在483 nm处荧光强度,而荧光强度差值与酪胺浓度呈正相关。该方法检测范围为0.1-100μg/L,检测限为0.05μg/L。该方法可特异性识别酪胺,与其他BAs及其结构类似物无交叉反应。方法准确性良好,食品样品中酪胺的本底含量与添加回收率的测定结果与HPLC测定结果具有很好的一致性(R~2>0.99)。方法可作为食品中酪胺的快速定量检测工具。(2)成功制备分别在483 nm与550 nm处有单一特征发射峰的发蓝色和绿色荧光的羧基修饰的Na YF4Yb/Tm与Na YF4Yb/Er UCNPs,制备双色荧光免疫信号探针,建立同时检测酪胺与组胺的荧光免疫检测方法。酪胺与组胺分子和相应捕获探针竞争结合信号探针,磁分离获得两种信号探针偶联相应捕获探针的偶联物。在483 nm与550 nm处荧光强度差值和对应的酪胺与组胺浓度呈正相关。在最佳条件下,该荧光免疫检测方法对酪胺与组胺的检测线性范围分别为0.5-100μg/L,0.1-100μg/L,检测限分别为0.1μg/L和0.01μg/L。该方法可特异性识别酪胺与组胺,与其他BAs及其结构类似物无交叉反应。应用于猪肉、金鲳鱼及米酒等不同食品中酪胺与组胺含量的一次性同时检测,检测结果与HPLC和UPLC-MS/MS的检测结果一致性良好(R~2>0.99)。本方法简化样品前处理过程,实现了一次测定过程中两种目标物的同时灵敏检测,方法有望拓展到其他食品危害因子或疾病生物标志物的同时检测。(3)成功制备分别在483 nm、550 nm和670 nm处有单一特征发射峰的发蓝色、绿色和红色荧光的羧基修饰的Na YF4Yb/Tm,Na YF4Yb/Er与Na YF4Yb/Er/Mn UCNPs,制备三色荧光免疫信号探针,构建三种BAs同时检测的免疫检测方法。基于酪胺、组胺与章鱼胺分子和相应捕获探针竞争结合对应信号探针,磁分离获得三种信号探针偶联相应捕获探针的偶联物。在483 nm、550 nm和670 nm处荧光强度差值和对应的酪胺、组胺和章鱼胺浓度呈正相关。在最佳实验条件下,该荧光免疫检测方法对酪胺、组胺和章鱼胺的检测线性范围依次为1-50μg/L,0.5-20μg/L和0.5-20μg/L,相应的检测限分别为0.5μg/L,0.1μg/L和0.1μg/L。该方法可同时特异性识别检测酪胺、组胺与章鱼胺,与其他BAs和结构类似物无交叉反应。该方法应用于猪肉、鲳鱼和鲈鱼中酪胺、组胺与章鱼胺的同时检测,测定结果与UPLC-MS/MS的测定结果一致性良好(R~2>0.99)。该荧光免疫检测方法结合多色UCNPs,实现了一次测定过程中三种BAs的快速同时检测,该检测策略很好的证实了UCNPs的多色标记的特点,同时也可以拓展到其他领域多重目标物的同时检测。(4)基于双寡核苷酸链信号放大技术与可同时识别IQ,Me IQ,IQx,Me IQx,4,8-Di Me IQx,7,8-Di Me IQx,4,7,8-Tri Me IQx和Ph IP等八种HAAs广谱特异性抗体,建立同时检测八种HAAs总含量的高通量荧光免疫传感检测方法。氨基修饰的寡核苷酸链(NH2-ss DNA)、HAAs广谱特异性抗体和Alexa Flour 488偶联的互补寡核苷酸链,偶联到Si O2微球表面制备荧光号探针,HAAs包被原偶联Au NPs作为荧光淬灭探针。在检测体系中没有目标HAAs时,荧光淬灭探针特异识别信号探针,体系荧光淬灭;当存在目标HAAs时,HAAs与荧光淬灭探针竞争结合荧光信号探针,体系荧光强度恢复。以Me IQx为分析物,该免疫检测方法的线性范围0.1-200μg/L,最低检测限为0.01μg/L。该方法应用于烤鱼,煎牛排,炸鸡中八种HAAs的总含量的检测,该免疫检测方法的测定结果与UPLC-MS/MS检测结果一致性良好(R~2>0.99)。本研究首次将广谱特异性抗体和寡核苷酸信号放大技术应用于HAAs的检测当中,即实现了一次测定过程中八种HAAs的同时高效检测,同时信号放大技术使得方法灵敏度与传统酶免疫分析相比提高了两个数量级。(5)基于单寡核苷酸链信号放大技术,建立同时检测八种HAAs总含量的高通量荧光免疫传感检测方法。6-FAM修饰的单寡核苷酸链和广谱特异性抗体偶联Au NPs作为荧光信号探针(此时荧光处于淬灭状态)。基于间接竞争反应原理,包被在黑色96孔微孔板的HAAs包被原,与待测HAAs竞争结合信号探针。洗涤未结合反应物后,结合在微孔中信号探针表面的荧光单寡核苷酸链,经二硫苏糖醇(DTT)释放后,体系荧光恢复,根据抑制率与HAAs的浓度建立标准曲线。以Me IQx为分析物,方法线性检测范围为0.01-50μg/L和检测限为0.0035μg/L。该方法应用于烤鸭和肉丸中八种HAAs的总含量的检测,检测结果与UPLC-MS/MS检测结果具有较好的一致性(R~2>0.99)。与使用双寡核苷酸链相比,应用单寡核苷酸链信号放大,即简化检测过程又节约成本,同样实现了检测灵敏度的提高。该检测策略也为食品安全因子的高灵敏检测提供了一个新的视角。
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