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果蝇作为一种重要的模式生物,从其被发现具有重要的科学研究价值开始,不同的新技术在果蝇中的成熟应用,使得果蝇在生命科学的研究中扮演着越来越重要的角色。尤其是在新基因的筛选和基因新功能的发现领域内,有着其他模式生物不可比拟的优势。 P-element是一类转座子,在转座酶的催化下能够将其上携带的DNA序列随机的插入到果蝇的染色体组上,是果蝇的基因组编辑中运用最为广泛的一种技术。Talens(transcription activator-like effector nucleases)和CRISPR/sgRNA(CRISPR-assoeiated single-guide RNA system)是最近几年发现的基因组编辑的新技术。Talens是transcription activator-like effectors(TALEs)和FokⅠ nuclease的融合蛋白,每个TALEs蛋白上有一个能够结合特异性DNA序列保守中心区域。通过不同单体拼接就能够构建出一个识别特异性的DNA序列的TALEs蛋白,通过左右臂两个不同的TALEs结合基因组上相近的DNA序列,FokⅠ核酸酶形成具有活性的二聚体结构,剪切识别序列中间的间隔序列,在基因组上产生DBS(double-strand breaks)。这种基因组损伤主要通过两种机制修复:nonhomologous end joining(NHEJ)和homologous recombination(HR),由此就能对基因组上进行knock in和knock out编辑。CRISPR/sgRNA系统和TALENs系统对基因组进行编辑的机制是一样的,通过编辑包含有20nt特异性的基因组识别序列的sgRNA,可以结合不同的基因组序列,然后募集Cas9核酸酶来剪切靶位点基因组序列产生DBS。 本实验分为三大部分,第一部分是利用传统的P-element技术在果蝇的四号染色体上引入FRT位点。通过构建带有FRT位点的P-element质粒,并将其注射到果蝇受精卵里,通过后续的杂交过程,成功将FRT位点引入到果蝇的Ⅳ号染色体离着丝粒约3/4位置上;第二部分在实验室现有的条件下,引进果蝇基因组编辑的新技术Talens和CRISPR/sgRNA系统,主要目的根据实验室的技术条件对Talens和CRISPR/sgRNA技术的进行实际的应用和优化,为今后实验室开展果蝇基因组编辑相关实验提供可靠的实验系统。通过Talens技术对Zfh启动子上的Ci结合位点和Stat结合位点进行定点突变,分别得到了23和1个品系稳定遗传突变体用于后续的研究工作;再利用CRISPR/sgRNA对果蝇的CG8060外显子上的两个不同位点进行定点的突变,分别得到了5个和2个品系的稳定遗传的突变体,比对其表型进行后续的研究。第三部分的工作,是尝试通过结合基因组编辑的传统技术和新技术,将FRT位点引入到Ⅳ染色体上更靠近于着丝粒的位置。通过Talens的技术尚未成功的引入FRT位点,转而优化实验条件,通过Cas9进行位点筛选与鉴定,再通过同源重组的方法引入FRT位点。目前已经筛选到了合适的定点插入位点,合适的同源重组的模板正在构建当中,需要后续的工作继续开展。