背景:感染性骨不连是骨科的难题之一,随着开放性骨折的发生率增加,感染性骨不连也随之上升,据报道约5%~10%的骨折会发展为骨不连。感染性骨不连中感染和骨缺损同时存在,很难彻底治愈,给患者及社会带来了严重的身心健康损害和经济负担。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是感染性骨不连的主要致病菌,超过70%的骨髓炎可检测出S.aureus。当前,感染性骨不连的治疗手段主要是进行抗感染、病灶清除,以及之后进行骨缺损的修复与重建,这些治疗方法都面临治疗时间长、多次手术、费用高及长期痛苦等问题,因此深入探讨感染性骨不连的相关机理以及新的治疗方法具有重要的意义。在开放性骨折中,骨组织和软组织暴露于外界,细菌侵入后在病灶区繁殖后,形成生物膜进而阻止抗生素进入杀灭细菌,常规抗生素治疗效果不理想。在骨髓炎中,生物膜中的细菌(如S.aureus)的表面相关蛋白能直接刺激细胞,其毒力因子可直接导致成骨细胞等凋亡,进而引起病灶区的骨破坏和骨丢失;S.aureus还能产生相关蛋白,如菌壁成分蛋白等,下调间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的成骨分化能力;上调其成脂分化的能力。G-细菌也是骨髓炎致病菌,该类细菌的菌壁成分脂多糖作为一种毒力因子,能够明显下调成骨细胞的骨生成能力;此外,致病菌还能诱导机体产生炎症因子,如IL-1、IL-6、IL-8及TGF-α,通过NF-Kβ信号通路导致宿主细胞死亡。作为骨髓炎的主要致病菌—SA,以往研究主要集中于其毒力因子引起成骨细胞的凋亡/死亡。骨折的修复过程中,骨折部位需要聚集足够数量的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),这些干细胞向成骨细胞的分化能力直接影响到了骨组织的骨生成和骨折愈合能力。感染条件下,大量细菌在机体免疫系统作用或在抗生素作用菌体裂解,菌体成分进入病灶并产生生物学影响。但一般认为骨内仅有细菌的存在并不足以造成骨髓炎,只有并发微环境血运障碍时才易引起骨髓炎。因此,感染性骨不连很可能还存在的其它影响因素,如骨折部位成骨细胞的祖细胞—h MSCs向成骨细胞分化下降等。萄球菌A蛋白(S.aureus protein A,SPA)是S.aureus细胞壁的成分,是S.aureus的重要毒力成分。SPA能和成骨细胞粘附后通过抑制碱性磷酸酶、I型胶原蛋白、骨钙素和骨桥蛋白的表达,抑制骨生成。SPA在骨髓炎中还能直接阻止成骨细胞增殖,诱导其凋亡和阻止矿基质的形成。从发育和遗传学来讲,作为成骨细胞的上游祖细胞h MSCs向成骨细胞分化的能力一定程度上决定了成骨细胞的数量和质量。但SPA是否也会影响h MSCs向成骨细胞分化的潜能及骨折的修复和愈合呢?到目前为止尚未见类似的研究报道。既往报道SPA能够粘附成骨细胞的前体细胞的表面受体TNFR-1,进入细胞内发挥效能,如启动凋亡信号的通路。此外,炎症或损伤环境中MSCs能表达的T样受体,且对其分化具有调节作用。由此,我们推测SPA也可以经TNFR-1受体介导进入h MSCs内并影响细胞的生物学性能,如影响胞内信号改变,进而影响细胞的功能。Wnt是一类富含L-半胱氨酸,对MSCs的分化起着重要的调节作用。但Wnt11主要通过依赖Ca2+的非经典Wnt信号通路即通过G蛋白激活磷脂酶C(phospholipase C,PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)途径,引起胞质内Ca2+的释放,参与发育、肿瘤及干细胞分化的调节。过表达Wnt11能协同TGF-β促进h MSCs向软骨细胞分化,表明Wnt11在MSCs的分化中起着重要调节作用。WNT11稳定的表达能够增加胞内游离钙离子,进而促进PKC的活性以及抑制NF-κB的活性。我们通过TESS(Transcription Element Search System)软件分析了Wnt11转录起始位点上游2000bp序列,发现存在SPA潜在结合位点,且可信度较高。此外,前期预实验结果提示h MSCs在SPA的刺激下向成骨细胞分化时,WNT11表达水平显著下降,提示SPA能够对h MSCs的Wnt11蛋白表达水平进行调节,但是否有其它因子和蛋白参与协调则暂时不清楚。研究目的:(1)探讨SPA对h MSCs在体内、外成骨分化的影响,进而明确是否SPA能够在体外显著降低h MSCs向成骨细胞分化的能力。(2)探索SPA刺激下WNT11/Ca2+信号通路在h MSCs成骨分化中的作用及机制,阐明SPA是否通过WNT11/Ca2+信号通路介导下调h MSCs的成骨分化能力。(3)从WNT11基因转录调控角度探讨感染条件下h MSCs成骨分化的机制;探索抑制和过表达WNT11及其上游蛋白能否控制SPA对h MSCs的成骨分化影响。(4)通过体外构建WNT11干扰和过表达的h MSCs,进而进行体外内实验探讨WNT11基因在体内外成骨分化中的作用和在体内感染性骨缺损模型中对骨修复的作用。通过以上体内、外实验,揭示WNT11基因及其非经典β-catenin信号通路在感染环境下h MSCs成骨分化和骨修能力的作用和可能的调控机制,为骨髓炎及感染性骨缺损的诊治提供实验依据和新的思路。研究方法:一.SPA对h MSCs成骨分化的影响及其机制从赛业生物有限公司采购经过大量研究证实的h MSC,进行体外的培养和扩增,并用于慢病毒的转染。应用细胞培养技术、干细胞分化技术、细胞染色技术、ALP活性检测技术、Quantitative RT-PCR和Western Blotting技术等检测SPA刺激下h MSCs成骨能力的影响。二.WNT11干扰及过表达h MSCs的建立及效果鉴定应用细胞培养技术、细胞增殖检测技术、干细胞分化技术、生物信息学分析技术、质粒构建技术、慢病毒包装技术、细胞染色技术、ALP活性检测技术、Quantitative RT-PCR和Western Blotting技术成骨能力评价载有WNT11干扰和WNT11过表达基因片段经慢病毒转染后的细胞相关基因表达水平变化,证实基因干扰和过表达的有效性,为后续其它实验提供实验基础。三.组织工程骨治疗感染性骨缺损模型的疗效评价通过不同h MSCs与PHA/FN/ALG复合支架体外构建组织工程骨植入新西兰大白兔胫骨感染性骨缺损的动物模型,在术后的1月时运用MRI和X线进行术后的观察,在1月后处死动物后的组织学微观观察支架中骨生成的情况;运用定量RT-PCR检测成骨特异基因。综合各检测结果,分析WNT11基因在体内环境上对h MSCs构建的组织工程骨骨生成能力的影响,以及分析WNT11/Ca2+非经典Catenin信号通路对上述过程的调控作用。数据应用SPSS 13.0软件作统计学处理,定量分析不同组间采用单因素方差分析(One-way analysis of variance,One-way ANOVA)进行分析,具有显著性差异后以配对T检验进行两组间的统计学分析。p<0.05被认为具有统计学意义。研究结果:1.SPA浓度梯度在体外界能不同程度影响h MSCs的成骨分化能力,在100ng/m L浓度时开始显现显著影响,并随着浓度增加而增加。2.经过生物信息学分析,将设计的基因序列片段经质粒构建后,经慢病毒转染后,quantitative RT-PCR和Western Blotting检测证实成功构建WNT11干扰和过表达的h MSCs。3.WNT11在体外100ng/m LSPA刺激下的MSCs的成骨分化中起着重要的正性调节作用;而在经典的WNT信号通路起着与非经典的WNT信号通路正向协调作用;WNT11能够一定程度抑制NF-κB的作用。4.WNT11过表达组h MSCs构建的组织工程骨在修复感染性骨缺损动物模型中,具有更好的修复能力,但是不能产生明星的临床修复能力。结论:1.SPA能够下调WNT11介导的非经典WNT信号通路,并能够显著下调h MSCs在体外的向成骨细胞分化的能力。2.WNT11在体外感染炎症条件下h MSCs成骨分化过程中起着重要的正性调节作用,可以作为一个潜在的调节靶点,发挥增强成骨分化的能力。3.WNT11在体内、外感染炎症条件下h MSCs的成骨过程中,能促进骨生成,具有作为潜在治疗靶点的意义。4.SPA毒力因子刺激炎症条件下,在h MSCs体外成骨分化过程中,非经典Wnt信号通路与经典Wnt/β-catenin信号通路相互关联,具有一定的协同作用。5.SPA毒力因子刺激炎症条件下,在h MSCs体外成骨分化过程中,非经典Wnt/Ca2+信号具有抑制NF-κB的作用。