研究背景与目的据文献显示,长时间适当剂量的溴乙啶(eflfidium bromide,EB)处理可以抑制线粒体DNA的复制和转录,但不会影响核DNA的复制。据此可建立线粒体DNA缺失细胞系。这些线粒体DNA缺失细胞系含有不规则的线粒体,并具有营养缺陷型嘧啶和丙酮酸依赖的特性。建立线粒体DNA缺失细胞系对于研究线粒体DNA和核基因组的相互作用以及线粒体DNA和核基因组的整合,有着极其重要的作用和意义。同时这些细胞系对于研究和了解线粒体以及线粒体DNA在细胞凋亡和肿瘤发生发展中的作用也有很重要的意义。马切蒂等应用肿瘤坏死因子和放线菌酮诱导细胞凋亡,在含有线粒体的细胞系U937和线粒体缺失的U937-ρ°细胞系上观察到了几乎相同的早期变化。根据文献,人前单核细胞白血病细胞系U937经过长时间溴乙啶暴露可转变为U937-ρ°细胞。我们应用不同引物,经过大量PCR实验证实,这些U937-ρ°细胞经过一段时间的实验室培养,可以重新充满线粒体DNA。而且这些细胞可以在正常的培养基(RPMI 1640加10%胎牛血清以及2mML-glutamine)中生长良好,这同时证明这些细胞具有有功能的线粒体和线粒体DNA。同时我们的进一步实验表明,在含有丙酮酸盐和尿嘧啶的培养基中培养的U937-ρ°细胞可以迅速紧密的粘附在培养瓶壁上,而在不含丙酮酸盐和尿嘧啶的培养基中,细胞悬浮在培养基中或仅仅松散的覆盖在培养瓶底。同时超微结构检查证明这些在无丙酮酸盐和尿嘧啶的培养基中培养的悬浮细胞与自然的单核细胞,比如U937细胞,非常相似。而在含有丙酮酸盐和尿嘧啶的培养基培养中出现的大的贴壁细胞则表现出分化的巨噬细胞的特征,这表明,丙酮酸盐和尿嘧啶具有促进细胞分化的作用。我们应用U937-ρ°细胞研究了线粒体DNA的恢复,应用大量实验证明了U937-ρ°细胞中线粒体的完整性。并运用超微结构分析了丙酮酸和尿嘧啶在促进细胞粘附中的作用。我们发现U937-ρ°细胞系在某种程度上可以恢复功能性线粒体以及完整的线粒体DNA,同时丙酮酸和尿嘧啶对于这些细胞系具有促进分化的作用。实验方法(一)U937-ρ°细胞对比体外培养,细胞平均分组后用不同培养基培养,倒置显微镜下观察各组细胞形态及生长速度的变化。(二)用电镜对不同实验组的细胞进行超微结构检查。(三)用PCR法检测细胞中的线粒体DNA。实验结果(一).A组在含有丙酮酸和尿嘧啶的培养基中培养的U937-ρ°细胞生长良好,大部分细胞可以在传代后24小时内迅速贴附在培养瓶壁上。培养过程中细胞紧密贴壁,必须用胰酶作用才能分离并收集细胞。B组在不含丙酮酸和尿嘧啶的培养基中培养的细胞则无明显贴壁,培养三天后,仍仅有少量的细胞贴附在培养瓶壁上,或全部漂浮在培养基里。培养中细胞可形成球形克隆,并悬浮在培养基中或仅仅松散的覆盖在培养瓶底。(二).A组贴壁细胞体积较B组悬浮细胞大,细胞内含有丰富的细胞器,如线粒体,粗面内质网,高尔基复合体,核糖体,多囊泡体(multivesicular body),被覆小泡。特别是这些细胞富含各级溶酶体(包括初级溶酶体和次级溶酶体),并且具有长的细胞突起和弯曲内陷的核膜,这些都表明了其具有分化的巨噬细胞的特征。B组细胞体积较小,细胞中细胞器较少,细胞突起短或比较平滑。A,B两组细胞内均可见球形线粒体,其结构紧凑,线粒体嵴清晰。均未见明显线粒体缺陷。(三)在线粒体DNA不同位点上的不同引物对经PCR反应检测均得到满意的扩增产物,说明其很可能具有完整mtDNA的表达。结论(一)丙酮酸盐和尿嘧啶核苷具有诱导细胞分化的作用;(二)经溴乙啶处理的线粒体缺失的细胞可以在一定条件下恢复其功能性的线粒体和线粒体DNA。