论文部分内容阅读
黑豆(Glycine max(L.)Merr)作为一种药食同源的豆类作物，在亚洲的应用历史悠久。黑豆种皮中含有丰富的花青苷，具有多种生物活性如抗氧化、抗癌、降血糖、抗菌、抗炎及神经保护等作用，但目前这些活性机制研究还不全面。花青苷的不稳定性通常会影响其性质和生物活性，从而使其应用受限，目前花青苷稳定化的方法存在一定弊端且相关机制不明确。黑豆中除了蛋白质和花青苷这些有益的营养因子外，还含有多种抗营养因子，例如胰蛋白酶抑制剂(BBTI)，该抑制剂会影响蛋白质的消化吸收，目前BBTI的钝化方法主要是物理法和化学法，二者具有很多不利影响，而关于利用天然活性成分钝化BBTI及作用机制的研究很少。我国饮茶历史悠久，茶叶中的茶多酚是一种具有多种生理活性的天然活性成分，茶和黑豆经常在日常饮食中摄入，但目前关于利用茶多酚钝化BBTI的研究较少。针对以上问题，本文研究了黑豆皮花青苷的抗氧化、降血糖、神经保护活性及其相关机制；进一步研究了黑豆皮花青苷的稳定化及其机制、花青素类化合物传递以及BBTI的钝化机理，为黑豆皮花青苷作为预防治疗相关疾病的功能性食品或药物研究提供理论依据，并为促进黑豆皮花青苷及其相关产品的应用奠定基础。本文主要内容如下：
(一)研究了黑豆皮花青苷的抗氧化和神经保护活性及机制。首先利用溶剂法从黑豆皮中获得黑豆皮花青苷提取物(BSSCE)，经高效液相色谱-质谱联用仪HPLC-MS测定其总花青苷含量为12%，组成为90.2%矢车菊素-3-O-葡糖苷(Cy3G)、5.3%飞燕草素-3-O-葡糖苷和2.3%芍药素-3-O-葡糖苷。然后利用体外细胞活性模型研究BSSCE的生物活性，结果表明BSSCE通过减少细胞内活性氧(ROS)的积累并增强内源性抗氧化酶(过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GPX)的活性，对HepG2肝癌细胞中H2O2诱导的氧化损伤发挥显著的保护作用。事实上，120μg/mLBSSCE可分别显著提高48.9%的CAT活性、77.1%的SOD活性及95.2%的GPX活性并显著降低55.7%的丙二醛(MDA)含量(P＜0.05)。采用人淀粉样β1-42蛋白(Aβ1-42)诱导PC-12细胞构建神经损伤模型并探究BSSCE的神经保护作用，结果显示，BSSCE对PC-12细胞中Aβ1-42介导的神经损伤具有显著的保护作用(100μg/mLBSSCE能使PC-12细胞中受Aβ1-42破坏而降低的细胞存活率从59.5%提高到89.0%)。综上结果表明BSSCE的神经保护作用可能与抗氧化酶系统的保护有关。采用分子对接技术进一步研究BSSCE的抗氧化及神经保护作用机制，结果表明，BSSCE显著的抗氧化活性和神经保护作用可能和其与靶蛋白之间通过疏水作用力和氢键建立的相互作用有关。
(二)研究了BSSCE及其主要成分Cy3G对蛋白激酶B(Akt)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的调节作用，从而阐明其降糖活性机制。采用大鼠骨骼肌细胞L6为体外活性模型研究了BSSCE对葡萄糖摄取的作用，结果显示，与正常对照相比，BSSCE和Cy3G显著增强了L6细胞中葡萄糖的摄取(P＜0.05)，经150μg/mL的BSSCE和40μM的Cy3G处理后，L6细胞中2-NBDG(脱氧葡萄糖类似物的荧光素，用以标记追踪活细胞内葡萄糖的摄取)的摄取量分别比正常对照组增加了1.8倍和1.9倍。利用WesternBlot技术研究了BSSCE的降糖机制，结果显示BSSCE和Cy3G促进了磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和GLUT4的表达以及GLUT4的易位，表明BSSCE通过调控Akt/GLUT4信号通路发挥降糖作用。这些结果说明：富含Cy3G的BSSCE有希望成为治疗Ⅱ型糖尿病及其相关代谢紊乱疾病的功能性食品或候选药物。
(三)研究了大豆分离蛋白(SPI)与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)的相互作用机理，从而阐明SPI对黑豆皮花青苷(BSSCE)的稳定化作用机制。采用紫外可见分光光度法(UV-Vis)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)，圆二色谱(CD)和荧光光谱法研究了SPI与Cy3G的相互作用机理。UV-Vis、FTIR及CD光谱的解析结果表明，预热处理(40,60,80,100和121℃)及与Cy3G的结合有效地改变了SPI的二级结构，使其α-螺旋结构和无规卷曲结构减少，β-折叠和β-转角结构增加。荧光光谱结果表明，在121℃下预热处理的SPI与Cy3G结合力最强，亲和力常数Ks为147.40×104M-1，且SPI主要通过疏水作用力和静态猝灭过程与Cy3G发生相互作用。体外稳定性实验表明121℃下预热处理的SPI对BSSCE具有最强的稳定效果。热稳定性测试结果显示121℃下预热处理的SPI有效降低了BSSCE67%的降解率，而氧化稳定性测试结果显示SPI有效降低了BSSCE23%的降解率，即显著提高了BSSCE的热稳定性和氧化稳定性。综上结果表明预热处理的SPI可以通过疏水作用力和静态猝灭过程与花青苷发生相互作用，从而有效提高花青苷的稳定性。
(四)采用简单快速的沉淀法成功制备了一种新型有效的多功能纳米传递系统CeO2@SiO2-PEG(CSP-NPs)以传递原花青素。为了证明纳米系统CSP-NPs在亲水性和疏水性药物递送中的潜在应用，将原花青素(PAC)和姜黄素(Cur)分别负载到CSP-NPs上并形成为PAC-NPs和Cur-NPs载药纳米颗粒。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)技术表征制备的纳米颗粒。FTIR和XRD结果证实了CeO2、PEG、PAC或Cur先后分步逐层沉积在SiO2核上，最终形成载药纳米颗粒。DLS、SEM、TEM分析及体外释放结果表明CSP-NPs，PAC-NPs和Cur-NPs呈球形，尺寸约为35-45nm，具有明显的可持续释放特性。利用乙酰胆碱酯酶(AchE)体外活性模型、HepG2肝癌细胞、PC-12神经细胞模型及共聚焦荧光显微镜研究PAC-NPs和Cur-NPs的活性，结果发现，CSP-NPs系统可以有效负载PAC和Cur，对HepG2细胞中H2O2引起的氧化损伤具有有效的保护作用；PAC-NPs和Cur-NPs具有较强的AchE抑制活性(1.0mg/mLPAC-NPs和Cur-NPs对AchE的抑制率分别为81.4±0.8%，78.8±2.1%)，且对PC-12神经细胞中人淀粉样β1-42蛋白(Aβ1-42)介导的神经毒性有很强的保护活性(在25μg/mL的剂量下，PAC-NPs和Cur-NPs将Aβ1-42降低的PC-12细胞存活率从57.5%提高至约81.0%)。此外，MTT实验结果表明PAC-NPs和Cur-NPs对HepG2和Hela癌细胞呈现出有效的抗增殖作用(P＜0.05)。综上结果表明CSP-NPs是一种有希望成为负载亲水性或疏水药物治疗氧化损伤，神经退行性疾病和癌症的药物传递系统。此外，该项研究还将为亲水性药物原花青素或疏水性药物姜黄素的应用提供潜在的递送系统，从而促进其广泛应用。
(五)研究了茶多酚(TPs)，茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表没食子儿茶素(EGC)对胰蛋白酶抑制剂BBTI的钝化作用及机制。首先采用体外活性检测法研究了TPs、EGCG及EGC对BBTI的抑制作用，结果表明，TPs，EGCG和EGC可以有效地抑制BBTI的活性，三者在200μg/mL剂量下对BBTI的抑制率分别为35%，51%和21%，EGCG对BBTI的较强抑制作用可能是由于其分子结构比EGC含有更多的活性羟基。然后利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、荧光光谱、等温滴定量热法(ITC)和分子对接技术探究了BBTI的钝化机制。FTIR和CD分析表明TPs，EGCG和EGC使BBTI的二级结构稳定化。荧光光谱结果表明EGCG和EGC通过静态猝灭过程和疏水作用力与BBTI发生相互作用。ITC分析和分子对接研究表明，EGCG-BBTI和EGC-BBTI的相互作用是自发进行的，且疏水作用力和氢键是其主要相互作用力。综上结果表明，EGCG是有效的BBTI钝化剂，具有提高黑豆产品安全性和营养价值的潜在作用和价值。
综上所述，本文综合研究了黑豆中营养因子花青苷的活性机制、稳定化机制及抗营养因子胰蛋白酶抑制剂的钝化机制。此外还成功制备了用以传递营养因子的纳米系统，为黑豆功能食品及相关药物的研发奠定了基础，并对促进黑豆资源的综合利用具有一定的理论价值。
(一)研究了黑豆皮花青苷的抗氧化和神经保护活性及机制。首先利用溶剂法从黑豆皮中获得黑豆皮花青苷提取物(BSSCE)，经高效液相色谱-质谱联用仪HPLC-MS测定其总花青苷含量为12%，组成为90.2%矢车菊素-3-O-葡糖苷(Cy3G)、5.3%飞燕草素-3-O-葡糖苷和2.3%芍药素-3-O-葡糖苷。然后利用体外细胞活性模型研究BSSCE的生物活性，结果表明BSSCE通过减少细胞内活性氧(ROS)的积累并增强内源性抗氧化酶(过氧化氢酶CAT、超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GPX)的活性，对HepG2肝癌细胞中H2O2诱导的氧化损伤发挥显著的保护作用。事实上，120μg/mLBSSCE可分别显著提高48.9%的CAT活性、77.1%的SOD活性及95.2%的GPX活性并显著降低55.7%的丙二醛(MDA)含量(P＜0.05)。采用人淀粉样β1-42蛋白(Aβ1-42)诱导PC-12细胞构建神经损伤模型并探究BSSCE的神经保护作用，结果显示，BSSCE对PC-12细胞中Aβ1-42介导的神经损伤具有显著的保护作用(100μg/mLBSSCE能使PC-12细胞中受Aβ1-42破坏而降低的细胞存活率从59.5%提高到89.0%)。综上结果表明BSSCE的神经保护作用可能与抗氧化酶系统的保护有关。采用分子对接技术进一步研究BSSCE的抗氧化及神经保护作用机制，结果表明，BSSCE显著的抗氧化活性和神经保护作用可能和其与靶蛋白之间通过疏水作用力和氢键建立的相互作用有关。
(二)研究了BSSCE及其主要成分Cy3G对蛋白激酶B(Akt)和葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)的调节作用，从而阐明其降糖活性机制。采用大鼠骨骼肌细胞L6为体外活性模型研究了BSSCE对葡萄糖摄取的作用，结果显示，与正常对照相比，BSSCE和Cy3G显著增强了L6细胞中葡萄糖的摄取(P＜0.05)，经150μg/mL的BSSCE和40μM的Cy3G处理后，L6细胞中2-NBDG(脱氧葡萄糖类似物的荧光素，用以标记追踪活细胞内葡萄糖的摄取)的摄取量分别比正常对照组增加了1.8倍和1.9倍。利用WesternBlot技术研究了BSSCE的降糖机制，结果显示BSSCE和Cy3G促进了磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和GLUT4的表达以及GLUT4的易位，表明BSSCE通过调控Akt/GLUT4信号通路发挥降糖作用。这些结果说明：富含Cy3G的BSSCE有希望成为治疗Ⅱ型糖尿病及其相关代谢紊乱疾病的功能性食品或候选药物。
(三)研究了大豆分离蛋白(SPI)与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(Cy3G)的相互作用机理，从而阐明SPI对黑豆皮花青苷(BSSCE)的稳定化作用机制。采用紫外可见分光光度法(UV-Vis)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)，圆二色谱(CD)和荧光光谱法研究了SPI与Cy3G的相互作用机理。UV-Vis、FTIR及CD光谱的解析结果表明，预热处理(40,60,80,100和121℃)及与Cy3G的结合有效地改变了SPI的二级结构，使其α-螺旋结构和无规卷曲结构减少，β-折叠和β-转角结构增加。荧光光谱结果表明，在121℃下预热处理的SPI与Cy3G结合力最强，亲和力常数Ks为147.40×104M-1，且SPI主要通过疏水作用力和静态猝灭过程与Cy3G发生相互作用。体外稳定性实验表明121℃下预热处理的SPI对BSSCE具有最强的稳定效果。热稳定性测试结果显示121℃下预热处理的SPI有效降低了BSSCE67%的降解率，而氧化稳定性测试结果显示SPI有效降低了BSSCE23%的降解率，即显著提高了BSSCE的热稳定性和氧化稳定性。综上结果表明预热处理的SPI可以通过疏水作用力和静态猝灭过程与花青苷发生相互作用，从而有效提高花青苷的稳定性。
(四)采用简单快速的沉淀法成功制备了一种新型有效的多功能纳米传递系统CeO2@SiO2-PEG(CSP-NPs)以传递原花青素。为了证明纳米系统CSP-NPs在亲水性和疏水性药物递送中的潜在应用，将原花青素(PAC)和姜黄素(Cur)分别负载到CSP-NPs上并形成为PAC-NPs和Cur-NPs载药纳米颗粒。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)技术表征制备的纳米颗粒。FTIR和XRD结果证实了CeO2、PEG、PAC或Cur先后分步逐层沉积在SiO2核上，最终形成载药纳米颗粒。DLS、SEM、TEM分析及体外释放结果表明CSP-NPs，PAC-NPs和Cur-NPs呈球形，尺寸约为35-45nm，具有明显的可持续释放特性。利用乙酰胆碱酯酶(AchE)体外活性模型、HepG2肝癌细胞、PC-12神经细胞模型及共聚焦荧光显微镜研究PAC-NPs和Cur-NPs的活性，结果发现，CSP-NPs系统可以有效负载PAC和Cur，对HepG2细胞中H2O2引起的氧化损伤具有有效的保护作用；PAC-NPs和Cur-NPs具有较强的AchE抑制活性(1.0mg/mLPAC-NPs和Cur-NPs对AchE的抑制率分别为81.4±0.8%，78.8±2.1%)，且对PC-12神经细胞中人淀粉样β1-42蛋白(Aβ1-42)介导的神经毒性有很强的保护活性(在25μg/mL的剂量下，PAC-NPs和Cur-NPs将Aβ1-42降低的PC-12细胞存活率从57.5%提高至约81.0%)。此外，MTT实验结果表明PAC-NPs和Cur-NPs对HepG2和Hela癌细胞呈现出有效的抗增殖作用(P＜0.05)。综上结果表明CSP-NPs是一种有希望成为负载亲水性或疏水药物治疗氧化损伤，神经退行性疾病和癌症的药物传递系统。此外，该项研究还将为亲水性药物原花青素或疏水性药物姜黄素的应用提供潜在的递送系统，从而促进其广泛应用。
(五)研究了茶多酚(TPs)，茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表没食子儿茶素(EGC)对胰蛋白酶抑制剂BBTI的钝化作用及机制。首先采用体外活性检测法研究了TPs、EGCG及EGC对BBTI的抑制作用，结果表明，TPs，EGCG和EGC可以有效地抑制BBTI的活性，三者在200μg/mL剂量下对BBTI的抑制率分别为35%，51%和21%，EGCG对BBTI的较强抑制作用可能是由于其分子结构比EGC含有更多的活性羟基。然后利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)、圆二色谱(CD)、荧光光谱、等温滴定量热法(ITC)和分子对接技术探究了BBTI的钝化机制。FTIR和CD分析表明TPs，EGCG和EGC使BBTI的二级结构稳定化。荧光光谱结果表明EGCG和EGC通过静态猝灭过程和疏水作用力与BBTI发生相互作用。ITC分析和分子对接研究表明，EGCG-BBTI和EGC-BBTI的相互作用是自发进行的，且疏水作用力和氢键是其主要相互作用力。综上结果表明，EGCG是有效的BBTI钝化剂，具有提高黑豆产品安全性和营养价值的潜在作用和价值。
综上所述，本文综合研究了黑豆中营养因子花青苷的活性机制、稳定化机制及抗营养因子胰蛋白酶抑制剂的钝化机制。此外还成功制备了用以传递营养因子的纳米系统，为黑豆功能食品及相关药物的研发奠定了基础，并对促进黑豆资源的综合利用具有一定的理论价值。