玉米皮中玉米黄质的制备、纯化及其抑制胃癌细胞生长机制的研究

来源 :黑龙江八一农垦大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tyycyf
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玉米黄质是一种类胡萝卜素,广泛存在于玉米、蛋黄、绿色蔬菜等食品中,其作为色素广泛应用于食品行业。同时,玉米黄质也具有潜在的健康调节作用,初期因其在治疗眼部疾病治疗中展现出良好的效果而被广泛熟知。近年研究表明,玉米黄质在预防或治疗消化系统疾病如食道癌、结肠癌等方面表现出较好的生物学功能,在相关研究中发现其对胃部疾病也具有一定的调节作用,但目前此方面的研究鲜有报道。玉米黄质不可自身形成,故需通过食物摄入,玉米是从食物中摄取玉米黄质的有效来源之一。玉米皮中含有部分玉米黄质,其作为玉米湿法生产淀粉的副产物,年产量超过200万吨,通常作为饲料使用,造成了严重资源浪费。本研究以玉米皮为原料采用酶法水解以及超声辅助溶剂法对玉米黄质提取和分离的方法进行优化,然后利用大孔吸附树脂和半制备液相色谱对其进行纯化处理;并通过体外实验来探讨玉米黄质对胃癌细胞的抑制效果及作用机制。此研究可为玉米皮的精深加工及综合利用提供理论支撑,为玉米黄质在调节消化系统疾病中的应用提供新思路。本研究各部分实验结果如下:(1)研究在单因素结果基础上通过响应面法对玉米黄质的提取工艺进行优化。以95%乙醇为提取剂,玉米黄质浓度为指标,其最佳提取工艺为用中性蛋白酶、酶解温度29℃、酶解料液比为1:20(m/v)、酶活性为20.9 U/mg、酶解5 h、提取时间为1.65 h、提取温度为39℃、料液比为1:16.2、超声功率为400 W时,玉米黄质的含量为208.36μg/g。(2)利用大孔吸附树脂和半制备液相色谱对玉米黄质进行分离纯化并对其抗氧化能力进行测定。首先利用AB-8大孔树脂对玉米黄质粗提液进行处理,以70%乙醇为洗脱剂,洗脱流速为1 m L/min,洗脱3柱体积(BV)时,玉米黄质的浓度为9.68μg/m L;其次用浓度为40%的KOH与样品液以1:1的比例进行皂化,得到的玉米黄质浓度为12.93μg/m L;最后通过半制备液相色谱对皂化后的提取液进行纯化,得到的玉米黄质纯度为73.41%。测得其对ABTS自由基的清除能力为95.27%、总抗氧化能力为0.235 Fe SO4(m M),其具有较好的抗氧化能力。(3)采用流式细胞术和蛋白免疫印迹法探讨玉米黄质对人胃癌细胞的抑制效果及作用机制。首先,通过CCK-8实验证实玉米黄质对人胃癌细胞有明显的杀伤作用但对人正常细胞的毒性作用较低;其次,检测在玉米黄质作用下的AGS细胞凋亡率,结果表明随着玉米黄质作用时间的延长,AGS细胞的凋亡率由1.71%增加到56.36%,同时细胞内的线粒体膜电位由90.35%降低到76.86%,其相关抗凋亡蛋白Bcl-2、pro-caspase-3和pro-PARP的蛋白表达水平被抑制,而促凋亡蛋白Bax、细胞色素C、cleave(cle)-caspase-3和cle-PARP蛋白表达水平有所增加;p-ERK、p-STAT3和NF-κB的蛋白表达水平被抑制,而p-p38、p-JNK、I-κB的蛋白表达水平增加,这说明玉米黄质可以调控MAPK通路;在添加p-ERK抑制剂后p-STAT3和NF-κB的蛋白表达水平被抑制,而在添加p38或JNK抑制剂后p-STAT3和NF-κB的蛋白表达水平有所升高,因此可以说明MAPK可以调节STAT3和NF-κB;当玉米黄质作用浓度增大时,人胃正常细胞GES-1的活性氧(ROS)水平有所降低,而随着玉米黄质作用浓度或时间的增加AGS细胞内ROS水平有所上升;与玉米黄质组相比,同时添加ROS清除剂NAC和玉米黄质组的AGS细胞的凋亡率有所减少,因此可以说明上调ROS水平可以诱导细胞凋亡;且与玉米黄质组相比,同时添加NAC抑制剂和玉米黄质组的p-ERK、p-STAT3和NF-κB的蛋白表达水平有所上升,而p-p38、p-JNK和I-κB的蛋白表达被抑制,这说明ROS可以调控MAPK信号通路;随着玉米黄质作用时间延长,AGS细胞在G2/M期的阻滞率由23.99%增加到36.73%,同时p-AKT、CDK1/2、Cyclin A和Cyclin B1的蛋白表达被抑制,而p21和p27的蛋白表达水平增加,在添加NAC抑制剂后p-AKT、CDK1/2、Cyclin A和Cyclin B1的蛋白表达水平上升,而p21和p27的蛋白表达被抑制。最后,对玉米黄质的作用机制进行探讨,发现玉米黄质可通过上调细胞中的ROS水平来调节MAPK信号通路诱导细胞凋亡;MAPK还可通过调节线粒体途径诱导细胞凋亡;此外,玉米黄质还可以通过上调细胞中的ROS水平使细胞在G2/M周期停滞,从而导致胃癌细胞凋亡。综上所述,本研究通过对玉米皮中玉米黄质的提取工艺进行优化,及其分离纯化后抗氧化能力的检测,探讨其对人胃癌细胞的抑制效果及作用机制,发现优化后的方法适用于玉米皮中玉米黄质的提取,且可得到较高纯度的玉米黄质,其抗氧化能力与对胃癌细胞的抑制作用密切相关。本研究为玉米黄质的良好来源提供新思路,为玉米的资源整合提供参考。
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