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目的:通过构建shRNA干扰下调人胸腺瘤细胞中Wnt4基因的表达,研究Wnt4基因对胸腺瘤细胞凋亡情况的影响。同时初步探索人胸腺瘤细胞中Wnt4基因发挥作用可能依赖的信号传导通路。方法:1.根据shRNA设计的相关标准,构建针对Wnt4基因的4个干扰位点,合成相应的序列片段,构建shRNA-Wnt4干扰质粒。经鉴定片段成功插入后,用LipofectamineTM2000作为媒介分别转染重组的四种干扰质粒和空白质粒到体外培养的人胸腺瘤细胞。采用RT-PCR检测转染后Wnt4 mRNA表达,并在四个重组质粒中挑选出对Wnt4基因抑制效果最好的干扰质粒进行后续实验。2.将体外培养的人胸腺瘤细胞分成4组:空白对照组;lipo2000组;转染TR001质粒组;转染干扰质粒组。用LipofectamineTM2000进行转染48H,采用Wright’s-Giemsa’s混合染色、Hoechst-33342/PI荧光双染色、流式细胞学分析、Western blot等方法检测人胸腺瘤细胞的凋亡。3.将体外培养的人胸腺瘤细胞分成3组:目的质粒组、空质粒(TR001)组、空白对照组;各组细胞按照分组处理后以LipofectamineTM2000转染不同质粒,采用RT-PCR及Western blot检测细胞Wnt4、JNK、β-catenin的mRNA及蛋白表达。结果:1.与相应对照组比较,四种shRNA-Wnt4干扰质粒中shRNA-Wnt4-3抑制率为52.37%(P<0.05)。作为抑制效果最佳的重组质粒进入下一步实验。2.与相应对照组比较,经过shRNA-Wnt4-3质粒干扰后的人胸腺瘤细胞的细胞凋亡率明显升高(14.70±0.62、p<0.001),差异有统计学意义。3.Wnt4基因下调后人胸腺瘤细胞内JNK基因表达也显著下调(P<0.01),且两者变化趋势一致。结论:1、shRNA-Wnt4-3质粒能够有效地抑制人胸腺瘤细胞中Wnt4基因的表达。2、通过干扰人胸腺瘤细胞中的Wnt4基因能够促进人胸腺瘤细胞的凋亡。提示Wnt4基因的异常表达可是部分人胸腺瘤发生和发展的机制之一。3、采用shRNA干扰Wnt4基因后体外培养的人胸腺瘤细胞内JNK基因表达显著下调,说明Wnt4基因与JNK基因的表达有一定的相关性,Wnt4基因可能依赖于非经典的Wnt/JNK信号通路发挥作用。