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铅、镉是环境中两种常见的重金属污染物;近年来,由于工业生产中铅、镉使用量的增加及相关工业废物带来的污染加重,环境中的铅、镉含量呈快速上升趋势。由于铅、镉常从许多天然和人工污染源同时进入环境而引起复合污染,因此铅镉联合暴露给公众健康带来的危害引起了广泛关注。肾脏是慢性铅、镉毒性损伤的靶器官和蓄积部位,国内外研究者从职业性暴露、环境污染及动物试验多方面对铅镉所致肾毒性机理进行了广泛研究;但铅、镉单独肾毒性作用的报道较多,而对两者的联合肾毒性研究则相对较少。本研究以SD大鼠为试验动物,通过体内和体外试验相结合的方法较系统地探讨了铅、镉及其联合对大鼠肾脏的毒性损伤效应及可能的作用机理,为进一步认识铅镉及其联合肾毒性作用提供了理论依据。一、体内试验1月龄雌性SD大鼠24只随机分为4组,每组6只,分别为对照组、铅组（300mgPbAc2/L）、镉组（50mgCdAc2/L）、铅镉联合组（300mgPbAc2/L+ 50mgCdAc2/L）。对照组大鼠自由饮用超纯水,其余各组自由饮用配置毒液,每天称量大鼠体重与饮水量,连续染毒8周,进行如下试验:①分别于染毒前一天、染毒后2、4、6、8周收集24h尿液,测定尿酶UALP、UNAG、UGGT、ULDH活性和尿蛋白UTP、Uα1-MG、Uβ2-MG、UmAlb含量的动态变化;同时测定尿液中Zn、Cu、Mn、Fe、Se排泄量的动态变化;②染毒结束,测定血清与肾皮质中Zn、Cu、Mn、Fe、Se、GSH、MDA含量和SOD、CAT、GSH-Px活性;③采用光学显微镜、透射电子显微镜观察染毒后大鼠肾皮质组织病理学及超微结构的变化;④采用荧光定量PCR法检测染毒后大鼠肾皮质中线粒体细胞色素氧化酶亚基COX-I、COX-II、COX-III mRNA表达量的变化;免疫组织化学法与荧光定量PCR法检测金属硫蛋白MT-1、MT-2在大鼠肾皮质中的表达。结果表明:①除染毒2周时Pb、Cd组Uα1-MG含量与Pb组UALP活性外,Pb、Cd组其余各项指标（UNAG、UGGT、ULDH、UTP、Uβ2-MG、UmAlb）均从染毒2周开始即显著或极显著高于对照组（P<0.05或P<0.01）,且升高幅度与染毒时间呈正相关;铅镉联合组从2周开始,所测各项指标均显著高于对照组（P<0.05）。在整个试验过程中,联合组各项指标均高于Pb组、Cd组,且在不同染毒时间有显著差异;②染毒结束,各染毒组血清与肾皮质中SOD、CAT、GSH-Px活性与GSH、Zn、Cu、Mn、Fe、Se含量均显著低于对照组（P<0.05）,但MDA含量均显著高于对照组（P<0.05）;③除染毒2周时尿Zn含量外,Pb、Cd组其余4种微量元素（Cu、Mn、Fe、Se）均从染毒4周开始尿中排泄量显著增多（P<0.05）;联合染毒除2周时尿Fe含量外,其它元素（Zn、Cu、Mn、Se）均从染毒2周开始尿中排泄量显著增多（P<0.05）;④各染毒组肾皮质部肾小管和肾小球有明显组织学病理变化,同时超微结构变化明显,表现核染色质分布不均、染色质边聚、近端小管刷状缘微绒毛脱落、线粒体肿胀、嵴断裂、部分或完全消失,铅镉联合暴露的病理学损伤较铅、镉单独染毒严重;⑤各染毒组大鼠肾皮质COX-I、COX-II、COX-III基因表达量均显著低于对照组（P<0.05）,以铅镉联合组降低幅度最大;⑥Pb组MT-1、MT-2表达量与对照组无显著差异（P>0.05）,但Cd组和铅镉联合组MT-1、MT-2表达均显著高于对照组（P<0.05）。结合上述试验结果,可以得出以下结论:①铅镉单独或联合暴露可损伤大鼠肾小管的重吸收功能和肾小球的滤过功能,其肾损伤程度与染毒时间呈正相关;②铅镉染毒可导致肾组织抗氧化功能降低,抗氧化微量元素含量降低加剧了氧化应激介导的肾组织损伤,染毒组大鼠体内微量元素含量降低与其尿液中排泄量显著增加直接相关;③铅镉暴露可引起肾皮质显著病理学损伤和多种细胞器损伤,其中线粒体损伤较显著;④染毒组肾皮质COX-I、COX-II、COX-III基因表达量显著下降可能与铅镉暴露导致的线粒体脂质过氧化损伤有关,金属硫蛋白MT-1、MT-2基因表达量显著升高在铅镉联合肾毒性过程中发挥重要作用。总之,铅镉联合肾毒性呈协同效应。二、体外试验采用机械筛网结合酶消化法建立大鼠原代肾小管上皮细胞（rPTCs）培养模型,在传一代细胞增殖活性最强时间段进行铅（0.5μmol/L、1μmol/L）、镉（2.5μmol/L、5μmol/L）单独或联合染毒。主要进行以下试验:①cck-8还原法测定不同组合的铅镉在不同染毒时间（3、6、12、24h）对rPTCs存活率的影响;②测定铅镉单独或联合染毒12h对rPTCs凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶释放率及凋亡形态学的影响,同时添加N-乙酰半胱氨酸（NAC）,观察其对铅镉所致细胞毒性损伤的保护效果;③测定铅镉染毒12h对rPTCs胞内SOD、CAT、GSH-Px活性及GSH、MDA含量的影响;④测定铅镉染毒12h对rPTCs膜ATP酶(Ca2+-ATPase、Na+/K+-ATPase)活性、胞内pH、线粒体膜电位、活性氧及钙离子水平的影响。结果表明,①铅镉单独染毒高剂量组从3h开始、低剂量组从6h开始,其细胞存活率显著低于对照组（P<0.05）;铅镉联合组从3h开始,细胞存活率极显著低于对照组（P<0.01）,且存活率降低幅度与染毒剂量、染毒时间呈正相关;②染毒12h,各染毒组细胞凋亡率、坏死率、乳酸脱氢酶释放率均极显著高于对照组（P<0.01）,且铅镉联合组各项指标均高于各相关单独染毒组;各染毒组细胞表现核皱缩、呈新月形、染色质致密浓染、核碎裂等典型凋亡特征;NAC对铅镉所致细胞凋亡有显著保护效应,但对细胞坏死率和乳酸脱氢酶释放率无明显影响;③与对照组比较,染毒组SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量均显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01）,而MDA含量均极显著升高（P<0.01）;④染毒各组细胞内活性氧和钙离子水平均极显著高于对照组（P<0.01）,线粒体膜电位水平、胞内pH、Ca2+-ATPase与Na+/K+-ATPase活性均显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）。上述试验结果可以得出以下结论:①铅镉暴露对rPTCs的毒性损伤呈浓度依赖性和时间依赖性,联合暴露呈协同毒性损伤;②细胞凋亡与细胞坏死是铅镉所致rPTCs死亡的2种死亡类型,其中凋亡性死亡在铅镉该剂量组合所致细胞损伤过程中发挥主导作用。氧化应激在铅镉染毒所致细胞凋亡性死亡过程中发挥重要作用,细胞内抗氧化酶活性降低进一步加剧铅镉对rPTCs的氧化损伤;抗氧化剂NAC对铅镉所致的肾小管上皮细胞毒性损伤有显著保护效应;③铅镉暴露导致rPTCs线粒体膜电位降低而促进细胞凋亡,同时细胞内酸化、钙离子超载、氧化还原平衡状态失调等一系列细胞内环境稳态失衡促进了细胞凋亡。总之,铅镉联合暴露对大鼠肾小管上皮细胞的损伤程度重于单独染毒,呈协同效应。