背景：本实验室曾利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)对比了肺癌与癌旁组织差异表达基因,发现DENND2D基因在肺癌中低表达。但迄今为止尚未发现有关于DENND2D的功能报道。目的：本课题旨在发现DENND2D在非小细胞肺癌发生发展过程中的表达规律以及在肺癌发生发展过程中的功能。方法：利用半定量PCR方法比较了15例原代培养的支气管上皮细胞株(primary cultured bronchial epithelial cell strains, PBEs)、永生化支气管上皮(immortalized human bronchial epithelial, IHBE)细胞以及27对肺癌/癌旁组织的DENND2D mRNA表达水平。检测了9株非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)细胞系DENND2D基因DNA拷贝数、mRNA表达水平以及蛋白表达水平。利用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)的方法检测了97例肺癌病人肺癌组织/癌旁组织的DENND2D蛋白表达水平,并利用Fisher精确检验对比了两者之间的表达差别。利用细胞增值实验、集落形成实验以及软琼脂凝胶集落形成实验检测了DENND2D对肺癌细胞增殖的影响。利用裸鼠成瘤实验检测了DENND2D对肺癌细胞成瘤性的影响。接着我们利用Western blot技术以及流式细胞仪技术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)检测了过表达DENND2D肺癌细胞系凋亡的变化情况。最后我们利用CCK-8检测了外源过表达DENND2D的H1299细胞系经过化疗药物顺铂处理后细胞存活的IC50值的变化,并利用Western blot技术检测了外源过表达DENND2D的H1299细胞顺铂敏感基因PARP1以及PARP1的DNA修复功能标志物蛋白PAR的表达量。结果：DENND2D mRNA在PBEs中高表达(15/15),但在IHBE (3/3)和NSCLC细胞系(8/9)中均为低表达。在NSCLC细胞系中,DNA拷贝数也出现降低(6/9)。与癌旁组织相比,肺癌组织中的DENND2D mRNA表达水平(13/27)与蛋白表达水平(23.6%vs81.5%,p<0.001)均显著下调。IHC数据显示DENND2D在肿瘤组织(IRS=0.90)以及癌前病变组织(IRS=1.38)的蛋白表达水平显著低于癌旁组织(IRS=1.97)。功能上讲,过表达DENND2D的NSCLC细胞系其细胞增殖能力、集落形成能力以及锚定非依赖生长能力均受到抑制。体内实验数据也表明DENND2D可以抑制肺癌细胞肿瘤形成能力。接下来我们检测了凋亡标志物cleaved PARP,其表达量在外源过表达的细胞中表达上调。FACS的数据也显示外源过表达的细胞凋亡率显著上升,并与DENND2D表达水平呈正相关。CCK-8检测顺铂处理的DENND2D过表达H1299细胞存活数据显示,相对于对照组,其IC50(50%inhibiting concentration)值显著降低。同时外源过表达DENND2D的H1299细胞PARP1PAR的表达显著降低。结论：DENND2D的低表达调控机制非常复杂,同时其低表达在肺癌肿瘤形成过程中是一个早期事件。在NSCLC细胞增殖和致瘤性两方面DENND2D均扮演着重要角色。其在NSCLC细胞中的功能主要表现为诱导凋亡和增强非小细胞肺癌细胞顺铂细胞毒性敏感性。实验背景：本实验室前期研究发现Brk1基因在参与Rac-Arp2/3的信号传导中具有较为重要的生物学地位,其异常表达可能是肿瘤细胞获得转移潜能的重要因素之一。目前有关HSPC300起始密码子上游的基因结构,顺式调控元件,以及相应的反式作用因子等均不清楚。实验目的：在转录水平了解引发HSPC300基因高表达的调控机理,为肿瘤细胞如何获得转移潜能提供更深层次的分子机理,为寻找控制细胞迁移运动的靶通路提供线索。实验方法：利用转录因子预测软件对Brkl基因5’侧翼区7KB范围进行预测,找到转录因子相对集中的区域,利用正常人类基因组DNA为模板进行扩增并测序。利用此为模板,对其分段扩增,并将上述片段克隆到荧光素酶报告基因质粒中成为重组质粒,并利用荧光素酶双报告基因平台检测其转录活性。利用截短法逐步截短活性强的片段,利用片段荧光素酶活性的改变找到Brk1基因核心启动子区所处位置。利用表达谱芯片数据筛选出非小细胞肺癌中与转移相关并与Brk1基因表达呈正相关的转录因子,与候选Brk1基因核心启动子区片段荧光素酶报告基因重组质粒共转染,检测荧光素酶活性是否增高。同时利用转录因子预测软件对候选Brk1基因核心启动子区进行分析,找到转移相关候选转录因子结合位点,将其突变,并检测其荧光素酶活性是否降低。实验结果：我们利用转录因子预测软件TFsearch和MATCHTM对Brk1基因5’侧翼区7KB范围进行预测,找到了转录因子相对集中的上游4.5KB区域并进行了扩增,测序结果显示与GenBank序列完全比对。分段扩增得到片段F1、F3、F5和F8,经过测序也与GenBank完全比对。双荧光素酶双报告基因检测结果显示片段F3和F8以及全长荧光素酶活性均显著增强,其中片段F3弱于片段F8。利用荧光素酶双报告基因检测片段F3和F8的截短体,发现了位于-3661—3212区段的候选弱启动子,位于-1314—934区段的候选增强子,位于-94—1(片段S831)区段的候选核心启动子区。通过对mRNA表达谱芯片数据的分析,我们找到了8个与非小细胞肺癌转移相关,并与Brk1基因表达呈正相关的候选转录因子。与片段S831共转染,发现在A549和H1299细胞中Jun能显著增强S831的转录活性,增强倍数分别为3.90倍和3.56倍。候选转录因子结合位点突变实验结果显示Sp1结合位点(-78-74)突变后S831片段的转录活性大大降低,在三株细胞中均降低90%以上。结论：起始密码子上游-78-74区段是Brk1基因核心启动子区,Sp1蛋白很可能通过与该区段的结合实现对Brk1基因关键的转录调控。