论文部分内容阅读
背景和目的：目前研究表明,脑血管疾病已成为造成人类死亡的重要疾病之一。脑出血是约占全部卒中的15—20%,有较高的死亡率和致残率,流行病学资料显示,全国每年新发脑血管病患者约为200万人；死亡约150万人；存活约600万；且大部分存活者有肢体、言语、吞咽等不同程度的神经功能缺损,给社会及家庭带来巨大负担。已往研究结果表明,出血后血肿周围区域微循环破坏及血肿直接压迫引起的缺血和水肿是脑出血引起脑损伤的主要原因,但目前研究发现,除血肿压迫外,脑出血后分解释放的多种活性物质参与了脑组织的损伤过程。微创穿刺清除颅内血肿技术是一种将钻颅、穿刺、固定融为一体的血肿粉碎技术,因其创伤小,术后神经功能恢复快,目前已广泛应用于临床。微创血肿清除术创伤小,利用流体力学原理结合生化酶技术,可有效的解除血肿占位效应,迅速降低颅内压,是清除血肿的有效方法,但不能阻断血液分解产物对血肿周围神经细胞的损伤。多项研究已证实,亚低温治疗是当前最有前途的神经保护方法之一,其疗效已得到广泛的认可。亚低温治疗脑出血通过多环节起到脑保护作用,已有人通过人工冬眠疗法降低全身温度进行亚低温治疗,但对于脑出血患者来说,有抑制呼吸等较大的风险,限制其临床的应用。目前关于亚低温治疗脑出血大部分采用冰帽降低颅外的温度的方法,很难直接对颅内的温度进行直接干预,且亚低温对出血后脑损伤的保护机理也尚不完全清楚。因此,本研究目的在于：通过亚低温对出血后神经细胞的钙离子通道及调亡的影响,探讨其保护机理；通过建立动物模型探明亚低温对出血后神经元损伤的保护机理；收集临床病例,采用微创血肿清术后联合血肿内低温灌洗的新方法治疗脑出血,观察其临床疗效。研究方法：1.采用C57/BL6J新生小鼠,分离出小鼠海马组织,培养原代神经元。定时更换培养液以便保持细胞活性。采用5-fluoro-2-deoxyuridine(10 μM)和uridine (10 μM)抑制胶质细胞的生长。被用于实验成熟神经元(12-16 DIV)分为三组：正常对照组,37℃常温组,33℃亚低温组,25℃低温组。除对照组外,其余三组神经细胞均采用母体小鼠全血进行干预,损伤神经细胞。1小时后ELISE法监测LDH指标反映细胞坏死程度,应用钙成像方法监测细胞内钙浓度,死亡神经细胞采用Hoechst-33342染色,荧光倒置显微镜观察,神经细胞凋亡情况用凋亡细胞占神经细胞总数百分比表示。2.用SD大鼠建立动物模型,分为对照(Control)组、脑出血(Intracerebral hemorrhage, ICH)组、假手术(sham operation, S0)组、微创(Minimally Invasive Surgery, MIS)组、MIS+37℃常温灌洗(Normal temperature, NL)组、MIS+33℃亚低温灌洗(Local Cooling Lavage, LCL)组。用尾状核注入Ⅳ型胶原酶诱导脑出血,6小时后应用自制大鼠颅内血肿穿刺装置进行血肿抽吸,然后分别给予37℃、33℃生理盐水进行血肿灌洗。实验大鼠被诱导脑出血24h后测定脑出血的的血肿体积；72小时后采用改良神经功能损害评分(modified Neurological Severity Score,mNSS)量表进行大鼠脑出血损伤后的神经功能障碍评分；HE染色观察血肿组织周围破坏程度；电镜观察血肿周围损伤神经细胞超微结构；ELISA法监测损伤脑组织的LDH、IL-1β、IL-10和SOD指标；DAPI+TUNEL免疫荧光双重染色监测神经元调亡,激光共聚焦显微镜观察并计数。3.纳入临床脑出血患者50例,其中微创手术治疗(Minimally Invasive Surgery, MIS)组20例；MIS+低温灌洗(Local Cooling Lavage, LCL)组30例。MIS给予单纯手术治疗,MIS+LCL组在微创治疗后予33℃生理盐水行局部低温灌洗,分别在治疗前、治疗后1d、7d、14d采用美国国立卫生研究院卒中量表(NIH Stroke Scale, NIHSS)评分标准对两组患者进神经功能缺损评分；在1个月后采用格拉斯哥预后评分(glasgow outcome scale, GOS)评定近期疗效。6个月后,按照日常生活能力量表(activities of daily living,ADL)分级评定远期预后。研究结果：1.被培养的海马神经元经过全血诱导损伤后,LDH水平显著增高,LDH水平在33℃亚低温组较37℃常温组低,并有统计学差异(P<0.05)；25℃低温组LDH水平最高,与37℃常温组比较有明显差异(P<0.05)。在全血诱导神经元损伤1小时后,在正常对照组中发现较少的调亡细胞。而33℃C亚低温组被损伤的细胞占全部细胞的比例为43±11.1%。37℃常温组受损细胞数所占比例为60±10.5%,较33℃亚低温组明显升高(P<0.05)。25℃低温组细胞损伤最明显,受损细胞数所占比例为83±13.5%,与37℃常温组比较有显著差异(P<0.05)。全血诱导神经元损伤后细胞内钙离子浓度明显增高。37℃常温组钙离子浓度较33℃亚低温组明显升高(P<0.05)。25℃低温组的钙离子浓度与37℃常温组比较无统计学差异。2.用胶原酶诱导的大鼠脑出血模型实验：(1)脑内血肿体积测定： MIS能明显减少出血大鼠脑内的血肿体积,与ICH组比较有显著差异(P＜0.05)。MIS+NL组与MIS比较血肿体积有减小趋势,但是统计学分析无明显差异。(2)MIS组mNSS与ICH组相比明显降低(P<0.05)；MIS+LCL组的mNSS较MIS组明显减少(P<0.05)。表明LCL在MIS基础上能够进一步改善ICH大鼠的神经功能缺损。(3)HE染色观察脑内血肿周围炎性细胞的数量。在对照组和S0组炎性细胞数无明显差别,ICH组炎性细胞数明显增多；而MIS组与ICH组比较明显减少了血肿周围的炎性细胞,有统计学差异(P<0.05)；在MIS+LCL组血肿周围浸润的炎性胞数较MIS组明显减少,统计学差异明显(P<0.05)。此外,在ICH组大鼠脑内血肿周围的组织结构破坏比较严重,而MIS减轻了这种破坏,LCL组与MIS组相比,LCL对血肿周围组织结构的破坏有进一步的保护作用。(4)SOD,LDH,IL-1β和IL-10的表达：MIS组与ICH组比较SOD表达水平无明显差异；在MIS+LCL组的SOD表达水平明显高于MIS组(P<0.05)。MIS组LDH的表达较ICH组明显减少(P<0.05)；MIS+LCL组与MIS组比较,LDH的表达进一步减少(P＜0.05);MIS+LCL组LDH的表达较MIS+NL组也明显减少,统计学差异明显(P<0.05)。ICH组的IL-10和IL-1 β表达水平均较对照组明显升高(P<0.05),证明脑出血激活了血肿周围的局部炎症反应。在MIS组,脑出血大鼠血肿周围IL-I0的表达较ICH组明显减少(P<0.05)；MIS+LCL组与MIS组相比IL-10的表达没有明显差异。MIS组IL-1 β的表达水平与ICH组相比显著降低(P<0.05)；MIS+LCL与MIS组比较IL-1 β的表达水平进一步降低(P<0.05)；MIS+NL组与MIS组的IL-1β的表达水平无明显变化。因此,MIS可以通过抑制IL-1β的表达减轻脑出血大鼠血肿周围局部炎症反应；而且MIS联合LCL治疗能进一步降低IL-1β的表达。但是NL对IL-10和IL-1β的影响均不明显。上述结果表明MIS虽不能增加出血后脑组织SOD的表达而提高组织抗氧化能力,但能够通过降低LDH水平减轻氧化应激反应,还可以通过抑制IL-1β的表达减轻脑出血大鼠血肿周围局部炎症反应。而LCL不仅能够增加SOD的表达提高组织抗氧化能力,同时也能降低LDH的表达抑制氧化应激。MIS联合LCL治疗能进一步降低IL-1β的表达。(5)神经细胞调亡检测：在ICH组TUNEL+细胞的表达最多,MIS组的TUNEL+细胞较ICH组明显减少(P<0.05)；MIS+ NL组与MIS组比较无明显差异,MIS+ LCL组TUNEL+细胞数较MIS组进一步减少(P<0.05)。表明MIS能够减少脑出血大鼠血肿周围神经细胞的调亡,而MIS联合LCL治疗对出血周围神经细胞的调亡有进一步的抑制作用。3.临床疗效观察：MIS+LCL组NIHSS评分较MIS组在治疗后1d、7d有减少趋势,但无统计学意义；在治疗后14天,MIS+LCL组NIHSS评分明显较MIS组减少,统计学差异明显(P<0.05)。2组近期临床疗效比较MIS+LCL组总有效率(86.7%)明显高于MIS组(75.0%),差异有统计学意义(P<0.05)。2组出院6个月ADL分级比较,MIS+LCL组良好-中残率(80.0%)显著高于MIS组(70.0%),差异有统计学意义(P<0.05),重残疾率(20.0%)明显低于MIS组(30.0%),差异有统计学意义(P<0.05)。研究结论：1.通过培养小鼠体外神经细胞,证实了亚低温可经减轻出血后损伤的神经元LDH的释放,减少了神经元的死亡。并应用钙成像实验证明了亚低温可能减轻出血损伤神经细胞内钙超载,对出血后损伤的神经细胞有保护作用。2.微创血肿清除术能够明显减少大鼠出血后的血肿体积,减轻血肿周围组织结构的破坏。联合亚低温灌洗后能够抑制出血后脑组织的氧化应激和炎症反应,提高抗氧化及抗炎水平,减少神经细胞的调亡,从而增强了对脑出血后神经功能损伤的保护作用。3.通过临床试验观察,颅内血肿微创术联合亚低温灌洗可以减轻脑出血患者神经功能缺损,可提高近期、远期疗效,降低致残率,提高患者生存质量。