UBE3B和未折叠蛋白通路在胃癌腹膜转移中的作用及机制研究

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目的:胃癌在全球是发病率最高的恶性肿瘤之一,并且具有很高的死亡率。腹膜转移是胃癌主要的转移方式之一(直接蔓延、淋巴结转移、血行转移和腹腔内种植转移)。腹膜转移常见的并发症为腹水和肠梗阻,严重影响患者的存活与生活质量。针对胃癌腹膜转移,紫杉醇是最常用的化疗方案之一。尽管早期有效,但大部分患者均对基于紫杉醇的治疗产生耐药性,并死于癌症进展。目前对胃癌腹膜转移发生的机制与耐药机制仍在探索中,仍未发现有预测预后价值及耐药的生物标志物。所以本研究的目的就是探索胃癌腹膜转移以及其耐药的分子机制。方法:1.通过蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测相关蛋白的表达水平。2.在HMr SV5细胞系中用慢病毒转染来稳定过表达UBE3B。3.通过定量实时聚合酶链反应(q RT-PCR)的方法检测相关目的m RNA的表达。4.Transwell实验用来检测过表达或者敲除目的基因后细胞的迁移能力。5.通过肿瘤细胞与腹膜间皮细胞之间粘附实验检测过表达或者敲除目的基因后腹膜间皮细胞的粘附能力的变化。6.采用si RNA或c DNA质粒转染技术对目的基因进行瞬时沉默或过表达。7.通过质谱分析的方法,筛选与UBE3B可能结合的蛋白。8.通过银染和考染的方法,验证与UBE3B结合的蛋白。9.免疫共沉淀(IP,Immunoprecipitation)方法检测UBE3B蛋白与KRT1蛋白能否结合。10.免疫荧光和免疫组化检测腹膜间皮细胞中UBE3B和KRT1蛋白的细胞定位与表达相关性。11.利用MTT实验实验检测细胞增殖能力。12.应用加权基因共表达网络(Weighted Gene Co-Expression Network Analysis,WGCNA)鉴定与未折叠蛋白反应相关模块。13.应用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验分析Cluster A和Cluster B人群的生存差异。14.应用单一样本基因集富集分析(ss GSEA)算法评价HALLMARKER中50个通路的评分。15.统计学分析:利用R软件(V4.0.0),Graph Pad Prism8和Social Sciences(SPSS)20.0版进行统计相关分析。实验数据显示为三次独立重复实验的平均值±标准差(SD)。使用Student’s t检验评估两组数据之间的差异。P<0.05认为具有统计学意义。结果:1.UBE3B在腹膜间皮细胞中转染效率的验证。通过慢病毒转染技术建立稳定过表达UBE3B的HMr SV5细胞系,并利用WB与PCR实验进行验证。2.UBE3B增强间皮细胞迁移能力。通过Transwell实验,验证过表达UBE3B之后腹膜间皮细胞HMr SV5迁移能力的变化,发现UBE3B过表达之后,间皮细胞的迁移能力显著增强。3.UBE3B促进肿瘤细胞粘附于腹膜间皮细胞。利用肿瘤与腹膜间皮细胞粘附实验证明了过表达UBE3B之后,腹膜间皮细胞HMr SV5对肿瘤细胞的粘附能力明显增强。4.UBE3B促进腹膜间皮细胞HMr SV5向CAF转化。通过WB实验,发现过表达UBE3B之后,HMr SV5当中的CAF相关指标α-SMA的表达显著上调,并且Vimentin明显上调。而Zo-1明显下调。5.UBE3B促进HMr SV5腹膜转移经典通路。本研究证实过表达UBE3B后,腹膜转移与腹膜纤维化相关指标psmad3与Notch1表达上调。6.KRT1是参与UBE3B促进腹膜转移的关键分子。利用质谱分析,检测了可能与UBE3B相结合的蛋白,并通过银染及考染实验发现其中KRT1可能是参与UBE3B促进腹膜转移前龛的关键分子。7.UBE3B可以与KRT1结合。利用免疫共沉淀及免疫荧光实验确认UBE3B可以与KRT1相结合。8.UBE3B促进HMr SV5中KRT1蛋白表达。为了进一步明确KRT1与UBE3B的关系,通过WB、PCR及免疫组化实验验证UBE3B过表达后,KRT1蛋白表达也上调,发现KRT1蛋白水平与UBE3B成正相关。9.UBE3B可能通过KRT1促进腹膜间皮细胞HMr SV5的迁移。在过表达UBE3B的腹膜间皮细胞HMr SV5中敲减KRT1,发现敲减后,腹膜间皮细胞的迁移能力显著下调。10.UBE3B可能通过KRT1促进肿瘤细胞向腹膜间皮细胞HMr SV5的粘附。在过表达UBE3B的腹膜间皮细胞中敲减KRT1,发现敲减后肿瘤细胞向腹膜间皮细胞的粘附显著下调。11.UBE3B可能通过KRT1促进HMr SV5的CAF化。在过表达UBE3B的腹膜间皮细胞中,将KRT1进行敲减,发现与CAF相关的指标均被逆转。12.UBE3B通过L区和KRT1结合。通过构建UBE3B的不同截短体,并利用免疫共沉淀实验,验证KRT1与UBE3B的哪个结构域结合,发现KRT1是通过UBE3B的L区段结合。13.UBE3B通过L区结构域发挥功能。通过向腹膜间皮细胞HMr SV5转染UBE3B-L结构域,发现其迁移粘附能力均显著增强。14.UBE3B促进KRT1 K63泛素化。分别向过表达UBE3B与正常腹膜间皮细胞HMr SV5中转染泛素质粒与KRT1质粒,利用免疫共沉淀实验发现在UBE3B过表达的细胞中,KRT1的泛素化增加。并进一步转染K48链的泛素与K63链的泛素,并通过免疫共沉淀发现,KRT1的K63链泛素化增强,而没有K48链泛素化。15.未折叠蛋白通路与腹膜转移相关。在GSE62254中筛选出腹膜转移的胃癌患者,通过ss GSEA评价HALLMARK中50个通路的评分。通过单因素COX筛选与患者OS,DFS相关的通路,发现未折叠蛋白通路的激活与更差的OS,DFS相关。利用WGCNA将这部分患者的基因进行分类,发现蓝色模块的基因与未折叠蛋白高度相关。16.通过蓝色模块中的基因,可以将患者分为两类,且与OS和DFS相关。17.探索Cluster A和Cluster B可能有效的药物。GDSC分析发现Cluster A和Cluster B IC50有差异的药物,发现这两类患者对紫杉醇的敏感性不同。18.不同胃癌细胞系对紫杉醇的药物敏感性不同。在不同的胃癌细胞系中验证了紫杉醇的IC50,发现NUGC4,与MKN45胃癌细胞系对紫杉醇相对耐药。19.紫杉醇相对耐药的细胞系NUGC4,与MKN45中未折叠蛋白通路相关分子有显著上调。20.抑制PERK与ATF4通路使胃癌细胞对紫杉醇治疗敏感。通过MTT细胞增殖实验发现敲减PERK/ATF4可以提高胃癌细胞系对紫杉醇的敏感性。2.PERK的抑制剂使胃癌细胞对紫杉醇治疗敏感。利用PERK抑制剂,作用于NUGC4,与MKN45胃癌细胞系,MTT增殖实验发现PERK抑制剂可以使胃癌细胞对紫杉醇治疗敏感。结论:1.UBE3B可能通过KRT1,促进PMCs向CAF转化,并促进胃癌腹膜转移。2.UBE3B通过K63链泛素化KRT1,从而达到稳定KRT1的作用。3.未折叠蛋白通路PERK/ATF4通路的激活,可能与胃癌肿瘤细胞对紫杉醇的敏感性相关。
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