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研究目的研究前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)在肺癌组织的肿瘤细胞和血管内皮细胞上的表达情况。分析PSMA在肺癌中表达情况与患者的年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、临床分期等因素的关系。构建AAV/PSMA质粒,制备AAV/PSMA病毒,用AAV/PSMA病毒转染树突状细胞,诱导生成细胞毒性T淋巴细胞。研究方法1.从天津医科大学附属肿瘤医院标本库选取非小细胞肺癌标本87例(包括鳞癌30例、腺癌29例、大细胞癌28例),小细胞肺癌30例,正常肺组织标本33例。这些标本同时用PSMA抗体和CD31抗体进行了免疫组化。免疫组化的阳性对照选择前列腺癌组织,阴性对照选用PBS。2.复苏培养扩增高表达目的基因PSMA的LNcap细胞。用Trizol法从高表达目的基因的LNcap细胞中提取总RNA。用mRNA抽提试剂盒从总RNA中抽提mRNA。 RT-PCR方法将mRNA逆转录为cDNA并将逆转录的cDNA进行扩增。利用QIAGEN公司的凝胶抽提试剂盒抽提凝胶中的目的基因。用T4连接酶将目的基因与腺相关病毒载体进行连接。将连接产物与感受态细胞混合进行转化和涂菌。挑选生长良好的单克隆菌落用LB培养基进行扩增培养。单克隆菌落扩增之后进行质粒抽提。抽提的AAV/PSMA质粒分别用PCR和基因测序两种方法进行验证并与GenBank公开的PSMA序列对比吻合。无腺病毒参与的包装系统制备AAV/PSMA病毒。3. AAV/PSMA转染DC并诱导生成CTL取健康人外周血,采用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞PBMC。取无菌10cm培养皿,按约8×107-12×107个细胞/皿,将PBMC加入培养皿中,补充AIM-V培养液。置二氧化碳培养箱培养,37℃,5%CO2,3小时。3小时后加入AAV/PSMA病毒,继续培养8小时。8小时后将悬浮的T淋巴细胞转移至T75或以上的细胞培养瓶中。根据悬浮细胞密度,决定需要培养液体积和细胞培养瓶的数量。培养瓶中加入细胞因子白介素-2,置二氧化碳培养箱中,37℃,5%CO2培养。培养皿底部贴壁细胞为树突状细胞。培养皿中加入AIM-V培养基、重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和白细胞介素-4。第六天将DC和淋巴细胞混合培养(DC：淋巴细胞为1：20)。混合培养阶段应每天在倒置显微镜下观察细胞集落情况,若观察到细胞集落稍有松散,则可判定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)已经被激活,CTL细胞培养完成。流式细胞仪检测树突状细胞的表型CD83、CD80和CD86; CTL抗肿瘤杀伤活性的检测：用带荧光标记的CD4、CD8、CD25、CD69抗体标记CTL细胞,以流式细胞仪进行检测,得到所培养的CTL细胞中CD4+CD8+、CD25+CD4+、CD69+CD8+的表达情况；用FITC-anti-IFN-γ标记CTL,以流式细胞仪检测,得到CTL细胞中IFN-γ的表达情况。用不同MOI的病毒转染DC并用流式细胞仪进行检测,得至AAV/PSMA病毒转染DC的最佳MOI数值。研究结果1.在非小细胞肺癌中,PSMA在肿瘤细胞上的阳性表达率为54.02%,在肿瘤血管内皮细胞上的阳性表达率为85.06%；在小细胞肺癌中,肿瘤细胞上没有PSMA阳性表达,在肿瘤血管内皮细胞上PSMA阳性表达率为73.33%；在与肿瘤相邻的正常肺组织上没有发现PSMA表达。2.成功构建AAV/PSMA质粒并制备AAV/PSMA病毒；经PCR验证,构建的质粒中成功插入PSMA基因,长度为720bp；树突状细胞中CD80、CD83和CD86的表达比例分别为54%、83%和72%；CTL中CD8/CD4为1.12,CD25+CD4+、CD69+CD8+和IFN-γ的表达分别为9.052%、42.76%和39%。研究结论PSMA特异性的表达于非小细胞肺癌的肿瘤细胞和血管内皮细胞；PSMA特异性表达于小细胞肺癌的肿瘤血管内皮细胞而不表达于肿瘤细胞；与肿瘤相邻的正常肺组织无PSMA表达；PSMA可能成为肺癌早期筛查的新标志物和治疗新靶点。以AAV为载体介导抗原基因PSMA转染DC可以成功诱导生成细胞毒性T淋巴细胞,PSMA作为肿瘤相关抗原在肺癌免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。