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目的:
为了进一步明确HBx基因在乙肝病毒相关性肾小球肾炎中的致病作用及相关机制，我们通过对22例HBV-GN患者的肾活检组织中肾小管上皮细胞的凋亡、凋亡相关蛋白及HBx表达进行相关分析;通过构建真核表达载体将HBx基因转染至体外培养的肾小管上皮细胞中，探讨HBx基因对肾小管上皮细胞的增殖和凋亡的影响，为乙肝病毒相关性肾炎分子机制的研究提供实验依据。
方法:
1、应用免疫组织化学的方法对22例HBV-GN患者及5例对照组肾组织分别检测HBx、p-STAT3、STAT3、Bcl-2及Bax蛋白的表达
2、采用TUNEL标记法检测22例HBV-GN患者及5例对照组肾组织中肾小管上皮细胞的凋亡
3、分析22例HBV-GN患者肾组织中肾小管上皮细胞凋亡指数与HBx表达、患者临床蛋白尿及HBVDNA定量的相关性
4、HBx基因真核表达载体pcDNA3.1-HBx的构建和鉴定
从HepG2.2.15细胞中提取总RNA，以总RNA为模板，采用RT-PCR方法扩增目的基因HBx(464bp)，将后者克隆到载体pcDNA3.1(+)，构建重组质粒pcDNA3.1-HBx。后者通过转化大肠杆菌DH5α、提取、电泳、测序以及酶切等方法进行鉴定。
采用脂质体转染法将pcDNA3.1-HBx转染至HK-2细胞，并用WB法检测目的蛋白HBx的表达。
5、CCK-8法检测细胞增殖抑制率
收集处于对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔100ul。细胞贴壁后，分别转染空质粒及pc-DNA3.1-HBx，并设对照组。细胞在37℃，饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h、48h、72h。CCK-8法检测各孔吸光度值（OD值），计算细胞生存率及增殖抑制率。
6、流式细胞仪检测细胞凋亡
收集处于对数生长期细胞，接种于6孔板。细胞贴壁后，分别转染空质粒及pc-DNA3.1-HBx，并设对照组及AG490干预组。细胞在37℃，饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h、48h、72h。消化收集各组细胞，Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞仪检测，分析细胞凋亡百分比。
7、共聚焦荧光显微镜观察细胞形态
收集处于对数生长期细胞，接种于6孔板。细胞贴壁后，分别转染空质粒及pc-DNA3.1-HBx，并设对照组。在37℃，饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h、48h、72h。固定细胞后，Hoechst33342荧光染料染色，共聚焦荧光显微镜观察、摄片。
8、透射电镜观察细胞超微结构
收集处于对数生长期细胞，接种于6孔板。细胞贴壁后，分别转染空质粒及pc-DNA3.1-HBx，并设对照组。细胞在37℃，饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h、48h、72h。消化收集各组细胞，置于2.5％戊二醛中固定。制成超薄切片，于透射电镜下观察细胞超微结构。
9、细胞免疫荧光/免疫化学检测细胞JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达
收集处于对数生长期细胞，接种于6孔板或12孔板中爬片。细胞贴壁后，分别转染空质粒及pc-DNA3.1-HBx，并设对照组及AG490干预组。细胞在37℃，饱和湿度、5％二氧化碳的培养箱中培养24h、48h、72h。细胞固定后，细胞免疫荧光/免疫化学法检测JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达，显微镜下观察、摄片。
10、Western blot方法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达
收集各组细胞，提取蛋白，用Western blot方法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达。
结果:
1、两组患者肾组织HBx、p-STAT3、STAT3、Bax及Bcl-2的表达
86％(19/22)的HBV-GN患者肾组织内存在不同程度的HBx表达，其主要分布于肾小管上皮细胞胞浆，肾小球内也有少数分布。与对照组比较，HBV-GN中STAT3、p-STAT3表达明显增强，Bax表达亦明显增加，而Bcl-2表达明显下降(均P＜0.05)。
2、两组患者肾组织肾小管上皮细胞的凋亡
HBV-GN患者肾组织可见TUNEL阳性细胞，凋亡指数为（16.82±3.35％），少数肾小球内也可见凋亡细胞。对照组肾组织极少见凋亡细胞。
3、HBV-GN患者肾组织肾小管上皮细胞的凋亡指数与HBx表达、临床蛋白尿及HBV-DNA的相关性
HBV-GN组患者肾小管上皮细胞凋亡指数与肾脏HBx表达有显著相关性(r=0.612，P=0.032)。凋亡指数与24h蛋白尿有显著相关性(r=0.824，P=0.020)。凋亡指数与HBV-DNA复制量无显著相关性(P=0.738)。
4、HBx基因真核表达载体pcDNA3.1-HBx的构建和鉴定
测序分析显示:HBx编码基因与Genbank发表的序列相符(ID:944566)。pcDNA3.1-HBx经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切释出插入子，与HBx基因(464bp)大小相一致。
pcDNA3.1-HBx转染肾小管上皮细胞24h后，Western blot分析显示，有分子量为17kD的HBx蛋白表达，72h达高峰。
5、CCK-8法检测细胞增殖抑制率
转染空质粒组细胞存活率与对照组无明显差别，提示对细胞无明显增殖抑制作用(P＞0.05)。转染pc-DNA3.1-HBx24h后，对细胞的增殖有明显抑制作用，达到（14.08±2.14）％。转染pc-DNA3.1-HBx48h后，细胞的增殖抑制率显著增加，达到(31.33±2.24)％。转染72h后，细胞的增殖抑制率达到(35.27±1.10)％，与24h有显著增加(P＜0.05)，但与48h无明显差别(P＞0.05)。
6、流式细胞仪检测细胞凋亡
转染空质粒组细胞凋亡率与对照组无明显差异(P＞0.05);转染pc-DNA3.1-HBx24小时组细胞的凋亡率为（15.12±1.98）％;转染pc-DNA3.1-HBx48小时组细胞的凋亡率（20.62±2.23）％;pc-DNA3.1-HBx72小时组细胞的凋亡率为（23.80±2.16）％。转染pc-DNA3.1-HBx后各组细胞的凋亡率较对照组组均显著增高，差异具有显著性(P＜0.05)。转染48小时较转染24小时组凋亡率显著增高，差异有显著性(P＜0.05)。但转染后48小时与转染后72小时无统计学差异。AG490干预组凋亡率为（14.34±2.63）％，与未干预组有显著差别(P＜0.05)。
7、共聚焦荧光显微镜观察细胞形态
对照组及转空质粒组细胞核形态正常;转染pcDNA3.1-HBx质粒24h、48h、72h组均可见细胞核呈波纹状或呈折缝样，细胞核染色质呈高度凝聚，核碎裂等。
8、透射电镜观察细胞超微结构
对照组及转染空质粒组细胞核近于圆形，核仁偏位存在，核膜清晰。HBx24h组、48h组、72h组:核仁不规则，有凹陷，核膜水肿，核内异染色质凝聚、边集。
9、细胞免疫荧光/免疫化学检测JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达
在对照组中，JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白均主要表达于胞浆，且p-STAT3蛋白表达很弱;转染pc-DNA3.1-HBx24小时组后p-STAT3蛋白水平明显增加，在72h时表达水平最高;转染pc-DNA3.1-HBx24小时后，总JAK2及STAT3蛋白水平亦明显增加，在72小时达高峰，主要在胞浆表达。在对照组中，Bcl-2有较高水平表达。转染pc-DNA3.1-HBx24小时组后Bcl-2表达水平有所下降，在72h表达水平降至最低。Bax在对照中肾小管上皮细胞中有少量表达;转染pc-DNA3.1-HBx24小时组后Bax表达水平有所上升，在72h在胞浆呈现高水平表达。AG490干预后，p-STAT3、STAT3及JAK2表达水平均有所下降。
10、Western blot方法检测JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3及Bcl-2、Bax的表达
对照组细胞中JAK2及STAT3有少量磷酸化，转染pc-DNA3.1-HBx24h后，p-JAK2及p-STAT3的表达均明显增高;总JAK2及STAT3表达也明显增高，随着转染时间延长，蛋白表达呈现逐渐增强趋势，转染72h达到高峰（P均＜0.05）。Bcl-2在对照组呈高水平表达，转染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bcl-2表达水平开始下降，至转染后72h降至最低（均P＜0.05）。Bax在对照组呈较低水平表达，转染pc-DNA3.1-HBx24h后，Bax表达水平开始增加，至转染pc-DNA3.1-HBx72h后，Bax表达水平最高（均P＜0.05）。AG490干预后，p-JAK2及p-STAT3的表达明显下降;Bcl-2水平增加，Bax蛋白水平降低（均P＜0.05）。
结论:
1、肾小管上皮细胞的凋亡是HBV-GN重要的病理特征。
2、HBx基因通过激活JAK2/STAT3信号通路，引起凋亡相关蛋白Bel-2/Bax比值下降，参与肾小管上皮细胞的凋亡。
3、AG490干预实验进一步验证了HBx通过激活JAK2/STAT3信号通路，凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值下降，引起肾小管上皮细胞凋亡的特异性。