随着传统抗生素在生产生活的过程中的过度使用,导致大量超级耐药菌的出现,严重威胁到人类的健康和养殖产业的发展。因此,探索和开发新型抗菌药物成为目前研究的热点领域。由于抗菌肽的广谱抗菌性以及独特的杀菌机制,使细菌难以产生耐药性,成为替代抗生素最有潜力的抗菌药物之一。近年来,越来越多的科学家们专注于抗菌肽的研发。天蚕素A抗菌肽具有较强的抗细菌、真菌及病毒和肿瘤等多种活性,在医药保健、食品领域和畜牧行业具有广阔的应用前景。目前,抗菌肽的制备主要有以下几种途径获得:自然界中分离提取、人工化学合成和生物重组表达。由于从自然界中分离提取和人工化学合成均存在操作步骤繁琐、制备成本昂贵以及得率低等缺陷,难以得到大量高纯度抗菌肽,严重阻碍了对抗菌肽深入的研究及推广应用。近年来,由于生物重组的方法具有操作简单、成本低以及得率高等优势,逐渐成为目前制备抗菌肽领域的热点。本论文探索、构建并评价了基于大肠杆菌的几种天蚕素A表达体系,在此基础上,对野生型天蚕素A抗菌肽进行分子改造,筛选得到高抗菌活性的天蚕素A突变体肽PEW300,并对其进行抗菌性能表征。为了降低抗菌肽的表达对宿主的毒性作用,构建了三种大肠杆菌表达体系:标签依赖表达体系(AT-HIS system)、非标签依赖表达体系(SA-ELK16 system)和无细胞表达体系(CF system)。通过从生产成本、生产周期以及最终天蚕素A抗菌肽的产率方面分别对三种表达体系进行了系统性评价:发现AT-HIS表达体系,存在纯化步骤繁琐昂贵,生产周期长以及产率低(0.41 mg/g菌体湿重);在CF表达体系无需细胞破碎等繁琐步骤,避免了天蚕素A抗菌肽对宿主细胞的毒性作用,最终获得产率为0.93μg/ml反应液的天蚕素A。但是由于其存在表达成本昂贵,产率低、需亲和层析等复杂步骤,尚不能满足规模化制备天蚕素A抗菌肽的需求。通过SA-ELK16表达体系,可以获得6.2 mg/g(菌体湿重)的天蚕素A,纯度高达99.8%,其产率大大超过了ATHIS表达体系和无细胞体系。SA-ELK16表达体系成本低廉、操作简便,无需亲和层析等繁琐步骤,只需简单离心即可获得高纯度的天蚕素A抗菌肽。但其仍需要细胞破碎,严重的阻碍了天蚕素A抗菌肽的大规模化制备。本论文探索并构建大肠杆菌胞外分泌系统,基因敲除改造Curi菌毛系统,将天蚕素A基因与纤维样蛋白Sup35NM进行融合表达,实现在大肠杆菌表面展示天蚕素A抗菌肽。通过荧光显微镜及透射电镜观察,天蚕素A成功分泌至大肠杆菌表面,并且以“Curi”菌毛的形式发生聚集。该分泌系统免除了进行细胞破碎及亲和层析等复杂步骤,通过简单离心收集菌体之后添加DTT诱导切割即可获得高纯度的抗菌肽天蚕素A。抑菌实验表明,基于此分泌系统获得的天蚕素A的抗菌性能与化学合成抗菌肽一致。为了提高天蚕素A抗菌活性,我们分析野生天蚕素A抗菌肽的一级序列和二级结构特征,理性设计多个突变体。在线模拟软件分析表明:突变体的正电荷数和疏水性能都有不同程度的增加。构建突变体表达载体,诱导表达天蚕素A突变体,并进行抗菌活性的初步筛选,结果显示突变体PEW300具有较野生型更强的抑菌性能。通过前期构建的SA-ELK16表达体系对PEW300进行大量表达及纯化,最终成功获得高纯度的PEW300突变体肽,其产率高达7.38 mg/g(菌体湿重)。测试纯化后的PEW300抑菌性能,显示出较野生型天蚕素A强抑菌性能,抑菌性能提高了4-7倍。另外,高浓度的(224 ng/μl)PEW300均没有出现溶血特性;PEW300在中性和碱性环境中展示出良好的稳定性;PEW300具有良好的热稳定性,并且对蛋白酶K,蜗牛酶,胃蛋白酶及胰蛋白酶具有良好的抗性。因此,PEW300突变体肽在医药领域具有良好的应用前景。