背景与目的喉癌是耳鼻咽喉科常见恶性肿瘤,手术治疗作为一种常用治疗手段已有一百多年历史,随着头颈外科的发展,喉外科手术不断完善,喉癌患者的5年生存率及生存质量明显提高;加之喉部解剖特点、喉癌免疫原性等其它因素的影响,喉癌被认为是相对预后较好的恶性肿瘤。但仍有30%-40%的患者,虽经根治手术和放化疗,仍因复发或转移而难以救治以致死亡。当患者手术后复发和/或出现远处转移时,肿瘤对放化疗多不敏感,导致预后较差。此类患者3年生存率约为10%。因此,如何进一步提高疗效成为当务之急。在分子生物学和基因工程飞速发展的推动下,免疫治疗日益受到重视,显示出良好的应用前景。NK细胞是天然免疫系统的主要效应细胞,具有广泛的生物学功能,位于机体抵抗肿瘤和病毒感染的第一道防线;不需要预先刺激即可识别并杀伤肿瘤和病毒感染的细胞,同时又能通过早期分泌多种细胞因子(如IFNγ、GM-CSF和TNF-β)和趋化因子来调节获得性免疫应答,因此,是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁。同时,NK细胞对自身免疫性疾病的调节亦引起了人们的重视。因此,尽管关于NK细胞的发育分化和识别功能的研究远远滞后于T细胞和B细胞,关于NK细胞功能和调节的研究仍是近年来人们的极大兴趣点,并有了突飞猛进的发展,成为免疫学研究的一大热点。近期的研究发现,NK细胞表面存在识别靶细胞表面分子的活化受体和抑制性受体,NK细胞的效应功能取决于活化信号与抑制性信号的综合。活化受体识别经典、非经典的MHCⅠ类分子或MHCⅠ类相关分子,在NK活化的启动方面起关键作用,其中尤为引人注目的是NKG2D,NKG2D的单独活化即足以刺激NK细胞的活化,并能克服抑制性受体的强势信号。NKG2D的配基为非经典的MHC样分子MICA(MHC classⅠchain-related A)、MICB(MHC classⅠchain-related B)及ULBPs(UL16-binding protein),这些分子在许多上皮及非上皮来源的肿瘤细胞、病毒感染细胞和受到“应激性刺激”的细胞均有表达或上调,表达MICA和/或ULBPs的肿瘤细胞普遍对NK杀伤较为敏感,MICA(-)的肿瘤细胞可因被转染以MICA而对NK细胞杀伤的敏感性明显增强。NKG2D与其配体的交联在肿瘤发生早期的天然免疫监视中可以介导对肿瘤的直接攻击,在肿瘤发生的中后期则是获得性免疫系统的共刺激信号,提示NKG2D和MICA、ULBPs的识别和作用在抗肿瘤免疫应答中发挥着重要作用。NKG2D的配体MICA在多数正常细胞和组织中不表达,但可由病毒感染、细菌感染和应激刺激诱导表达,并在许多上皮肿瘤(如黑色素瘤、结直肠癌、乳腺癌等)均有表达。NKG2D及其配体的相互作用在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用,靶细胞上NKG2D配体的表达水平几乎决定了NKG2D的活化与否和机体NK细胞免疫应答的强弱,并且可以克服主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex,MHC)Ⅰ类分子介导的抑制性信号,因此,在NK细胞活化过程中起着举足轻重的作用。喉癌组织中MICA及ULBPs表达情况目前尚未见国内外文献报道,如果喉癌组织中存在MICA及ULBPs高表达或协同表达,则可利用NK细胞的自然杀伤效应进行生物治疗的探讨性研究。目前世界上有六株细胞系被确认具有典型NK细胞标志,它们是:YT、NK-92、NKL、HANK-1、KHYG-1和NK-YS。这些细胞系的免疫表型为CD1~-CD2~+ CD3~- CD4~- CD5~- CD7~+ CD8~- CD16~- CD55~+ CD57~-,具有NK活性,有/无ADCC效应。在这些细胞系中,YT细胞,来自一急性淋巴母细胞淋巴瘤和胸腺瘤患者,1985年建系,为IL-2非依赖或低依赖细胞系,具有NK细胞的典型表面标志,但由于长期在实验室传代培养,只能检测到NKG2D的mRNA表达,而不易检测到其蛋白的表达。YT细胞相对于NK-92和NKL细胞而言,其杀伤活性相对较地低。我们选用YT细胞作为NKG2D转染细胞的受体,来探讨NKG2D分子的作用机制。本研究首先检测人喉癌细胞Hep2及喉癌组织中NKG2D配体MICA,ULBP1,2,3的mRNA和其蛋白表达,了解NK细胞用于喉癌生物治疗的可行性。其次通过基因工程手段构建NKG2D的真核表达质粒,转染YT细胞(NK细胞系),筛选单克隆细胞,建立表达NKG2D的效应细胞,将效应细胞与喉癌细胞Hep2接触后观察转染NKG2D前后NK细胞对喉癌细胞的杀伤功能变化,为NK细胞用于喉癌生物治疗的可行性提供理论依据。方法(1)应用RT-PCR方法检测人喉癌细胞Hep2及喉癌组织中NKG2D配体MICA,ULBP1,2,3的mRNA表达。(2)NKG2D克隆载体的构建。从NK细胞系NK-92细胞中经RT-PCR技术获得NKG2D cDNA,与pGEM-T Easy连接及转化大肠杆菌后,构建NKG2D克隆载体,进行DNA序列测定。(3)NKG2D真核表达载体的构建。应用限制性内切酶将NKG2D基因从克隆载体上切下来,连接到荧光真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-N1/NKG2D真核表达载体。(4)真核表达载体在CHO细胞中的表达及鉴定。将筛选出的pEGFP-N1/NKG2D质粒通过脂质体转染到CHO细胞中,经G418筛选,克隆,RT-PCR鉴定NKG2D mRNA的表达,荧光显微镜、Western Blot和免疫组化方法鉴定NKG2D蛋白的表达。(5)真核表达载体转染YT细胞及对YT细胞生物学功能影响。将pEGFP-N1/NKG2D质粒通过脂质体转染到YT细胞中,免疫组化方法检测NKG2D蛋白在NKG2D转染前后的变化;MTT方法检测YT细胞转染前后的增殖情况及对人喉癌细胞Hep2的杀伤情况;RT-PCR技术检测杀伤相关分子,即抗病毒分子IFNγ、细胞增殖分子IL-2、溶膜分子perforin和诱导细胞凋亡分子家族TNF超家族(TNFα、Fas/FasL、TRAIL、TWEAK)的转录水平,并同时设置β-actin为RT-PCR系统的内参照。结果(1)人喉癌细胞Hep2及喉癌组织中NKG2D配体MICA,ULBP1,2,3的mRNA检测。应用RT-PCR检测Hep2细胞和21例新鲜喉癌组织中MICA,ULBP1,2,3的表达,同时以声带息肉组织作为对照,发现Hep2细胞和喉癌组织中NKG2D配体MICA,ULBP3呈强势表达,说明喉癌易于引起NK系统免疫应答,有NKG2D用于喉癌生物治疗的研究价值和良好前景。(2)NKG2D全长cDNA的克隆。提取新鲜培养的NK-92细胞的总RNA,取5ug总RNA为模板,以oligo(dT)为引物进行逆转录反应。然后用NKG2D的特异引物进行PCR反应,PCR产物经电泳鉴定和与pGEM-T Easy载体连接、酶切鉴定后测序,证实已获得的cDNA为NKG2D的全长cDNA,结果与文献报道一致。(3)pEGFP-N1/NKG2D重组表达载体的构建。用EcoRⅠ和BamHⅠ从克隆载体pGEM-T Easy/NKG2D切下NKG2D片段,与经相同双酶切的pEGFP-N1质粒进行粘性末端连接。产物转化感受态大肠杆菌HB101,利用PCR筛选阳性克隆,提取纯化PCR阳性重组质粒进行双酶切鉴定,经PCR和双酶切鉴定阳性的克隆即为构建好的pEGFP-N1/NKG2D重组表达载体。(4)NKG2D在CHO细胞中的表达。应用脂质体法将构建好的pEGFP-N1/NKG2D重组表达质粒分别转染CHO细胞,G418筛选培养基培养后,挑选抗性克隆,RT-PCR鉴定mRNA的表达,荧光显微镜下观察有绿色荧光发出、Western Blot和免疫组化方法鉴定蛋白的表达。结果显示构建的pEGFP-N1/NKG2D质粒能够转染CHO细胞并且有NKG2D的蛋白表达。(5)NKG2D真核表达载体转染YT细胞及对其生物学功能影响。应用脂质体法将构建好的pEGFP-N1/NKG2D重组表达质粒分别转染YT细胞,免疫组化方法检测NKG2D蛋白在NKG2D转染前后的变化;MTT方法测定转染前后的细胞增殖效应和对喉癌细胞Hep2的杀伤情况,RT-PCR技术检测杀伤功能相关分子的变化。结果显示YT细胞转染前后增殖效应没有变化;NKG2D蛋白在NKG2D转染后明显增强;NKG2D转染YT细胞后对Hep2细胞杀伤活性有明显增强作用,杀伤相关分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明显增强。结论(1)人喉癌细胞Hep2和喉癌组织中NKG2D配体MICA,ULBP3呈强势表达,说明喉癌易于引起NK系统免疫应答,有NKG2D用于喉癌生物治疗的研究价值和良好前景。(2)通过基因工程技术获得了全长的NKG2D基因片段,并且测序正确,成功构建了pEGFP-N1/NKG2D真核表达载体。(3)经转染CHO细胞后,能够在荧光显微镜下发出绿色荧光,RT-PCR检测出mRNA的表达,Western Blot和免疫组化方法鉴定蛋白的表达。(4)转染YT细胞,转染前后增殖效应没有变化;NKG2D蛋白在NKG2D转染后明显增强;NKG2D转染YT细胞后对Hep2细胞杀伤活性有明显增强作用,杀伤相关分子IFNγ、IL-2、TNFα、Perforin、TWEAK有明显增强。(5)NKG2D基因修饰YT细胞为使用NK细胞系进行免疫治疗奠定了理论和技术基础。上述研究表明,喉癌是一种易于引起NK系统免疫应答的肿瘤之一,是喉癌相对预后较好的又一佐证,为NKG2D受体用于喉癌生物治疗展示良好前景。YT细胞一方面可以作为基础研究的工具,用于研究NK细胞分化发育和对肿瘤细胞杀伤机理的探讨,阐明NKG2D受体对NK细胞活性的调节机制,另一方面,通过基因转染,可以有目的、有针对性地对NK细胞进行修饰,使得NK细胞更适合临床过继免疫治疗肿瘤的应用。