目的:砷是一种广泛存在于自然界的类金属元素,人类可通过饮用砷污染的地下水、食用砷污染的蔬菜和稻米及含砷药物接触到砷。慢性砷暴露不仅可以引起皮肤损伤、糖尿病、心血管疾病、肿瘤,也可导致骨代谢紊乱。流行病学调查显示,慢性砷暴露会增加各种骨骼疾病的发病风险,动物及细胞实验表明,砷一方面通过抑制成骨细胞分化导致骨类疾病的发生,另一方面低剂量的砷暴露(2.5-5μM)通过增加过氧化氢生成促进破骨细胞分化。据此,本研究第一部分利用C57BL/6背景下的野生型小鼠及原代细胞和细胞系模型体内体外实验相结合,探讨砷对破骨细胞分化的影响。科室的前期结果及大量实验表明,砷可激活Nrf1和Nrf2,在细胞增殖、分化和行使生物学功能过程中起到重要的作用。Nrf1和Nrf2同属于CNC-bZIP转录因子,可与sMaf蛋白结合形成异二聚体,结合到靶基因启动子近端的抗氧化元件,调控启动多种基因的表达。Nrf1广泛表达于多种组织,其不仅介导抗氧化反应,还参与调控包括组织发育、蛋白酶体稳态、线粒体呼吸、脂质代谢和细胞分化等多种生理过程。Nrf1可通过调节DSPP和维生素A而影响成牙质细胞和成骨细胞的分化和功能,Nrf1也可通过减少osterix的表达而调控间充质干细胞向成骨细胞的分化。且人群调查结果显示,Nrf1与血中成骨相关的指标的表达量成正相关。但其在破骨细胞分化过程中的作用尚无文献报道。Nrf2在破骨细胞分化过程中起到重要的作用,Nrf2可以通过上调抗氧化酶表达降低细胞内的ROS水平而抑制破骨细胞的分化。在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中,可通过降低Nrf2/Keap1的比率,降低细胞内抗氧化酶的表达水平,促进破骨细胞的分化和功能。据此,本研究的第二部分应用Nrf1/Nrf2髓系细胞特异性敲除的小鼠、Nrf1/Nrf2缺失的原代和细胞系及Nrf1过表达的细胞系的体内外实验相结合,探讨Nrf1/Nrf2在破骨细胞分化过程中的作用及其机制。Nrf2可对抗外来的氧化损伤,保护细胞,在Nrf2缺失的鼠中,对电离辐射的敏感增加,易发生骨质疏松,科室的前期结果也表明,Nrf2的缺失可导致小鼠对外来刺激的敏感性增加。据此,本研究的第三部分应用Nrf2全身和髓系细胞特异性敲除的小鼠构建慢性饮水砷暴露模型,探讨Nrf2在砷对破骨细胞分化影响中的作用,应用Nrf2缺失的原代和细胞系细胞研究探讨相关机制。研究方法:1、野生型C57BL/6小鼠构建骨质疏松模型并进行砷暴露处理5月龄雌性C57BL/6小鼠随机分为假手术组和去势手术组,其中假手术和去势手术组又细分为对照组(蒸馏水)和染砷组(5 ppm和20 ppm,三价无机砷(iAs~Ⅲ):五价无机砷(iAs~Ⅴ)=1:1),砷暴露3个月后,采用Micor-CT和双能X射线检测骨密度。利用骨髓诱导的前破骨细胞和RAW 264.7细胞系研究不同浓度iAs~Ⅲ对破骨细胞分化的影响,利用ROS清除剂NAC研究砷对破骨细胞分化影响的机制。2、髓系细胞Nrf1特异性敲除小鼠构建骨质疏松模型3月龄雌性C57BL/6髓系细胞Nrf1特异性敲除及对照小鼠随机分为假手术组和去势手术组,两个月后采用Micro-CT和双能X射线检测骨密度并收集病理及血清学指标,研究Nrf1对骨的影响。3、Nrf1缺失及过表达细胞诱导分化并应用相应抑制剂处理利用Nrf1敲除的髓系细胞及Nrf1沉默和过表达的RAW 264.7细胞系研究Nrf1对破骨细胞分化的影响及相关机制。应用糖代谢抑制剂2-DG和ROS清除剂NAC处理基础状态下和分化过程中的破骨细胞,研究Nrf1对破骨分化的影响及相关机制。4、Nrf2全身敲除小鼠进行染砷处理10月龄雌性的Nrf2全身敲除及对照组小鼠随机分为对照组和5 ppm砷处理组。砷暴露4个月后,采用Micro-CT和双能X射线检测骨密度并收集病理及血清学指标,研究在砷导致骨密度下降过程中,Nrf2在其中的作用及相关机制。5、Nrf2缺失细胞诱导向破骨细胞分化并应用砷及相应抑制剂处理利用Nrf2敲除的髓系细胞和Nrf2沉默的RAW 264.7细胞系研究不同浓度砷对破骨细胞分化的影响。利用ROS清除剂NAC及p38抑制剂SB203580处理分化过程中的细胞研究砷对破骨细胞分化的影响及其相关机制。结果:1、砷对骨的影响与假手术对照组比,单纯20 ppm染砷组小鼠股骨骨密度下降;去势手术组整体骨密度下降明显,但其中5 ppm和20 ppm组的骨密度与非染砷去势组相比无显著变化;RAW 264.7细胞和骨髓造血干细胞体外培养均显示低剂量iAs~Ⅲ显著影响破骨细胞分化并呈现明显的剂量-效应关系,低剂量促进破骨细胞分化而高剂量产生细胞毒性从而显示一定的抑制效应。进一步机制研究发现抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸显著抑制低剂量iAs~Ⅲ暴露促进的破骨细胞分化,并呈现明显的剂量-效应关系。2、转录因子Nrf2和Nrf1在破骨细胞分化过程中的作用在破骨细胞分化过程中,Nrf2及其下游基因表达水平降低。Nrf2全身敲除及组织特异敲除与对照组比其骨密度无明显变化。进一步的体外实验证明Nrf2缺失可导致破骨细胞分化和功能增强。在破骨细胞分化过程中Nrf1先升高后降低。Nrf1缺失的小鼠中破骨细胞数目增加、功能增强且股骨骨密度下降,去势处理后,其骨密度下降的更明显。髓系细胞体外培养和RAW 264.7细胞均显示Nrf1缺失的细胞向破骨细胞分化能力增加。进一步的机制研究发现Nrf1的长亚型对NFATc1有正向调控作用,短亚型对NFATc1调控有负向调控作用,表明Nrf1可通过调节NFATc1的表达而对破骨细胞分化产生影响。Nrf1缺失后,其细胞内的ROS水平升高、代谢增强、NF-κB信号通路活化,表明Nrf1也可通过细胞代谢水平等的改变而促进破骨细胞分化。3、转录因子Nrf2在砷所致骨密度下降中的作用在破骨细胞分化过程中Nrf2降低。5 ppm的砷处理Nrf2缺失小鼠骨密度下降明显,对照组小鼠骨密度无明显变化;RAW 264.7细胞和髓系细胞体外培养均显示低剂量的砷可显著促进破骨细胞分化,且在Nrf2缺失的细胞中,其促进效果更明显。进一步的机制研究发现抗氧化剂NAC和p38抑制剂SB203580可显著抑制Nrf2缺失导致的NFATc1表达水平升高,并抑制砷引起的破骨细胞分化增强。结论:1、砷暴露引起的氧化应激可通过促进破骨细胞分化而引起骨密度下降。抗氧化剂可有效的抑制砷引起的破骨细胞分化增强,提示抗氧化剂的干预可能用于防治砷暴露引发的骨质疏松。2、体外实验显示,髓系细胞Nrf2缺失可增强破骨细胞分化,但在基础状态下,Nrf2缺失对骨密度无影响。Nrf1缺失可通过增加破骨细胞数目和增强破骨细胞功能而导致小鼠股骨骨密度下降。进一步的机制研究发现Nrf1主要通过升高NFATc1的表达水平、增强代谢、提高ROS水平及改变NF-κB信号通路引起的破骨细胞分化增强。提示Nrf1可作为预防和治疗骨质疏松新的靶点。3、Nrf2缺失的小鼠对砷引起骨密度降低的作用更敏感。进一步的机制研究表明抗氧化剂NAC和p38抑制剂SB203580可显著抑制Nrf2缺失导致的NFATc1表达水平升高,并抑制破骨细胞分化。提示应用抗氧化剂和p38抑制剂的干预可能用于防治砷暴露引发的骨质疏松。