论文部分内容阅读
鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起雏鸭的一种急性、高度致死性传染病,以肝炎为主要特征。近年来,该病的发病率和死亡率不断上升,严重危害养鸭业的健康发展。本病包括三种类型,Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,分别由Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒引起,其中Ⅰ型和Ⅲ型属于小RNA病毒科,Ⅱ型属于星状病毒科。国内外主要流行Ⅰ型鸭肝炎。根据已发表的DHV-1基因组保守序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法对DHV-1 161/79/V株的基因组序列进行分段扩增并测序。测序结果拼接后,进行BLAST在线同源搜索,确定为Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组序列,并提交GenBank,登录号为EU753359。序列分析表明,整个基因组除3’poly(A)以外,全长7653个核苷酸,编码2249个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别为589nt和314nt,只有一个ORF ,多聚蛋白裂解位点比较保守,最终形成12个成熟的蛋白,依次为VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D。借助生物信息学软件,对DHV-1 161/79/V株全基因组序列组成,以及DHV的分子演化关系等进行辅助分析。与已发表22株DHV-1基因组序列比对结果表明,161/79/V株与DHV-1 JH2株亲缘关系最近,核苷酸和氨基酸序列一致性分别为97.1%和98.7%。进一步以VP1基因绘制DHV系统进化树,发现进化树形成明显的三个群,分别为:DHV-1各毒株、韩国变异株、台湾变异株,三个群之间核苷酸序列一致性为68.8～72.8%,氨基酸序列一致性为69.3～77.3%,而各群内部毒株之间的核苷酸和氨基酸序列一致均高于90%,推测这三个群的病毒是三个不同的基因型,而测定的161/79/V株位于DHV-1所在的群内。本试验从基因水平上研究病毒的进化情况,揭示与其它毒株的亲源关系,分析其基因型,为该病在流行病学和预防控制方面的研究奠定基础。在测定DHV-1 161/79/V株基因组序列的基础上,设计1对引物扩增VP1基因,将其克隆到表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-VP1。将pET-VP1转入E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS中,进行诱导,摸索最佳表达条件。结果表明在0.5mmol/L的IPTG浓度下诱导6h,可以得到较高浓度的蛋白表达量。在16℃条件下诱导,重组蛋白以可溶形式表达,但存在形式不稳定,易于沉淀;37℃下诱导,重组蛋白以包含体形式表达,并能够稳定存在。在变性条件下,用His-Ni~+亲和层析法纯化重组蛋白,得到约47ku的融合蛋白Trx-His-VP1,经测定蛋白浓度为0.2mg/mL。Western Blot和间接ELISA检测结果显示融合蛋白能够被DHV-1阳性血清识别,而与阴性血清无反应,表明融合蛋白Trx-His-VP1具有良好的抗原性。该结果为进一步以此作为诊断抗原,建立快速、准确的诊断方法提供了理想的实验材料。