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不同肌肉纤维类型肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain,MyHC)亚型基因是目前公认的区分不同肌纤维类型的分子标记,因此发现调控MyHC亚型基因的表达调控机制,对提高肉质性状和肉品质具有重要的意义。FHL3蛋白属于LIM蛋白超家族成员之一,不能结合DNA启动子序列,只能通过结合其它转录因子调控下游基因表达。迄今为止关于FHL3是否调控MyHC各亚型基因表达还未见报道。本研究以小鼠C2C12成肌细胞为模型,展开了FHL3对四种MyHC亚型基因的影响及其调控的分子机制的研究,取得了如下主要研究结果:1.利用构建的FHL3超表达载体pcDNA3.1-FHL3和针对FHL3基因的干涉(siFHL3)片段转染C2C12成肌细胞,采用实时定量PCR、Western blotting、和免疫荧光技术检测了超表达和干涉FHL3基因前后MyHC各亚型基因表达变化;发现了FHL3对MyHC 2a和MyHC 2b有正调节作用,对MyHC 1/slow有负调节作用,而对MyHC 2x无影响。2.开展了共转染试验,首先利用pcDNA3.1-FHL3和Myo D干涉片段共转C2C12细胞,发现干涉MyoD同时超表达FHL3后MyHC 2a,MyHC 2b蛋白水平仍有显著增加,而MyHC 1/slow表达水平却没有显著变化。之后利用pcDNA3.1-MyoD和FHL3干涉片段共转染C2C12成肌细胞进一步验证,发现干涉FHL3后,增强了Myo D超表达对MyHC1/slow基因表达的促进作用。以上结果表明FHL3主要通过抑制MyoD转录活性下调MyHC1/slow基因表达,而对MyHC 2a,MyHC 2b基因的表达调控可能存在其它机制。3.开展了MyHC 2a启动子区域缺失片段与pcDNA3.1-FHL3共转染C2C12成肌细胞试验,发现FHL3超表达显著提高了含有环化的AMP反应元件(cyclic AMP-responsive elements,CRE)的启动子活性,在此基础上,通过CREB超表达和干涉试验验证了CREB能够促进MyHC 2a基因表达。4.开展了pcDNA3.1-FHL3和CREB干涉片段(siCREB)共转染细胞试验,验证了FHL3是通过CREB蛋白调控MyHC 2a基因表达,并且磷酸化CREB(pCREB)在调控MyHC2a基因表达中发挥着主要作用;利用免疫沉淀技术验证了FHL3可以与CREB、pCREB、MyoD及其共转录激活因子p300相互结合,当MyoD和pCREB两种蛋白共同存在的情况下,FHL3与pCREB的结合能力更强。5.利用EMSA和ChIP技术检测了CREB与MyHC 2a基因启动子CRE元件的结合能力。结果表明非磷酸化的CREB与pCREB都能结合MyHC 2a启动子上的CRE结合元件,但以pCREB结合为主,并且FHL3基因干涉后显著降低了pCREB与MyHC 2a启动子的结合能力。综上所述,FHL3对MyHC 2a和MyHC 2b基因的表达具有正调节作用,对MyHC1/slow基因表达有负调节作用;FHL3通过抑制MyoD转录活性下调MyHC 1/slow基因表达,同时通过与pCREB和p300蛋白互作上调MyHC 2a基因表达。本研究结果将为不同肌肉纤维类型形成的分子调控研究开拓新的思路和途径,同时也为动物肉用性状的遗传改良提供重要的理论依据。