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目的:阐明胰腺和肺组织细胞凋亡在重症急性胰腺炎(SAP)并发急性肺损伤(ALI)病理过程中的作用;从Notch/Hes信号转导角度,探讨重症急性胰腺炎并发急性肺损伤过程中细胞凋亡的调控机制;明确大黄素抗重症急性胰腺炎并发急性肺损伤的作用靶向和调控环节。方法:144只大鼠适应性饲养1周后随机分为模型组(136只)和假手术组(SO组,8只)。模型组应用3.5%牛黄胆酸钠(1ml/kg体重)经胰胆管逆行注射建立SAP肺损伤模型;SO组仅暴露并轻微翻动胰腺,其余手术过程同模型组。模型组随机分为模型对照组、大黄素低剂量组(简称低剂量组)、大黄素中剂量组(简称中剂量组)和大黄素高剂量组(简称高剂量组)4组。每组再随机编入3、6、12、24h共4个时相点。低、中、高剂量组大鼠分别在造模前后1h按照1ml/100g体重的标准经腹腔注射相应剂量(分别为10mg/Kg、20mg/Kg、和40mg/Kg体重)的灭菌大黄素溶液(4%蔗糖脂肪酸酯配制);假手术组和模型对照组经腹腔注射等容量的4%灭菌蔗糖脂肪酸酯溶液。各组分别在3、6、12、24h时相点处死大鼠,按要求留置血清,胰腺和肺组织标本;假手术组在造模后3小时进行标本留置。经全自动生化仪检测血清淀粉酶和总钙水平;常规胰腺和肺组织病理切片并HE染色,由专业人士进行病理评分;测定左肺湿/干重比值(W/D);经分光光度仪检测肺组织MPO含量;TUNEL法检测胰腺和肺组织细胞凋亡,计算凋亡指数(Ⅵ);实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time quantitative, RT-PCR)法检测Notch-1,Hes-1和Hes-5的mRNA表达;免疫组化和免疫印迹法(Western blotting)法检测胰腺和肺组织Notch-1,Hes-1和Hes-5的蛋白表达量。结果:(1)血清淀粉酶和总钙:模型大鼠血清淀粉酶水平随着时间延长而呈现明显增高趋势,每个时相点与假手术组比较均有显著统计学差异(P<0.01);同时,模型组大鼠血清总钙则呈现下降趋势,尤其在6h以后较假手术组显著降低(P<0.01)。应用不同剂量的大黄素进行干预治疗后,虽然各组AMS水平呈现上升趋势,血清总钙水平仍呈现下降趋势,但是各治疗组24小时内整体血清淀粉酶和总钙水平较模型对照组均有不同程度的改善。治疗各组的血清淀粉酶均较模型对照组显著降低(P<0.01),高剂量组较低剂量组降低更明显(P<0.05);治疗各组的血清总钙水平均较模型对照组显著增高(P<0.01),高剂量组较低剂量组增高更明显(P<0.05)。(2)组织病理评分:胰腺病理评分方面,模型各时相点评分整体呈增高趋势,且均显著高于SO组(P<0.01);模型6h时相点的评分高于模型3h和12h两个时相点,24h时相点的评分相对最高。肺组织病理评分方面,模型各时相点评分均显著高于SO组(P<0.01);前12h该项评分呈现增高趋势,并在12h时相点达到峰值。经过治疗后,中剂量组和高剂量组胰腺病理评分均较模型对照组明显改善(P<0.01),高剂量组改善最显著,而低剂量组与模型对照组无显著统计学差异(P>0.05);肺组织病理评分方面,各治疗组均较模型对照组有明显改善(P<0.05),高剂量组显著优于低剂量组(P<0.05)。(3)肺组织MPO:在前12小时,各时相点模型肺组织MPO水平呈现逐级升高趋势,并且与SO组均有极显著性差异(P<0.01); 12h时相点MPO水平达到峰值,显著高于其他时相点(P<0.01); 24h时相点MPO水平较前明显下降。经干预治疗后,治疗各组MPO水平均较模型对照组显著下降(P<0.05),低剂量组与中剂量组间无统计学差异(P>0.05),而高剂量组显著优于低剂量组和中剂量组(P<0.01)。(4)肺组织湿/干重比值(W/D):在前12小时,模型大鼠的肺组织W/D呈现逐级增高趋势,各时相点比值均显著高于SO组(P<0.01),并在12h时相点达到峰值;24h时相点模型肺组织W/D明显下降,较6h (P<0.01)和12h (P<0.01)均有显著统计学差异,但仍高于SO组(P<0.01);经干预治疗后,模型对照组和治疗各组的W/D在前12小时内仍然呈现上升趋势,并在12h时相点达到峰值;但治疗各组均较模型对照组显著降低(P<0.01),高剂量组显著优于低剂量组(P<0.05)。(5)细胞凋亡指数:模型胰腺细胞AI在3h即达到峰值,6h显著下降,12h再度升高,24h则降至低谷;镜下模型胰腺的凋亡细胞主要为中性粒细胞、淋巴细胞、胰腺滤泡细胞和少量血管内皮细胞等。模型肺组织细胞AI在各时相点均显著高于SO组(P<0.01);在3h时相点,AI达到相对峰值,之后呈现下降趋势,24h再次回升;镜下模型肺组织的凋亡细胞主要为中性粒细胞、淋巴细细胞等炎性细胞以及少量肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等。治疗各组的胰腺细胞凋亡指数在不同时间点均较模型对照组有不同程度升高,但低剂量组与模型对照组无显著统计学差异(P>0.05),中剂量组和高剂量组则显著高于模型对照组(P<0.05),高剂量效果最显著;治疗各组肺组织细胞凋亡指数均显著高于模型对照组(P<0.01),且中剂量组和高剂量组均显著高于低剂量组(P<0.05),中剂量组和高剂量组间无显著统计学差异(P>0.05)。(6)胰腺组织中Notch-1, Hes-1,Hes-5的mRNA表达:模型大鼠的Notch-1 mRNA表达整体呈现曲折下降趋势,各时相点均显著低于SO组(P<0.01),6h时相点较3h(P<0.05)和12h (P>0.05)降低明显,24h时相点最低;模型Hes-1 mRNA表达量在各时相点均显著高于SO组(P<0.05),6h达到峰值,12h降至低谷,24h再度呈现回升趋势;模型Hes-5 mRNA表达在3h即达到峰值,显著高于SO组(P<0.05)和24h时相点(P<0.05),之后呈现下降趋势。经过干预治疗后,低剂量组表达量较模型对照组明显增高(P<0.05),中剂量组和高剂量组则较模型对照组增高更加显著(P<0.05);治疗各组的胰腺组织Hes-1mRNA的差异(数据离散度)较大,但从整体而言仍较模型对照组明显增高(P<0.05);治疗各组胰腺组织Hes-5 mRNA表达量均较模型对照组有不同程度增高,但低剂量组与模型对照组无显著统计学差异(P>0.05),而中剂量和高剂量组的表达量均较后者显著增加(P<0.01)。(7)肺组织中 Notch-1, Hes-1,Hes-5 的 mRNA 表达:模型大鼠 Notch1mRNA 表达量在各时相点均显著低于SO组(P<0.05), 12h表达量降至低谷,24h呈现回升趋势;模型大鼠Hes-1 mRNA表达量呈现低高交替的趋势,12h表达量最低,且显著低于SO组和24h表达量(P<0.05); Hes-5 mRNA表达量呈先降后升趋势,6h表达量最低,之后表达量逐级回升。经过干预治疗,治疗各组的肺组织Notch-1 mRNA表达量均较模型对照组显著增高(P<0.01),其中高剂量组效果最好,较低剂量组和中剂量组显著增加(P<0.01);治疗各组的肺组织Hes-1 mRNA表达量也均较模型对照组显著增高(P<0.01),高剂量组显著高于低剂量组(P<0.05),而中剂量组和高剂量组间无显著统计学差异(P>0.05);治疗各组的肺组织Hes-5mRNA表达量较模型对照组有增加趋势,其中低剂量组与模型对照组无显著统计学差异(P>0.05),而中剂量组和高剂量组则显著高于模型对照组和低剂量组(P<0.05),高剂量组亦显著高于中剂量组(P<0.01)。(8)组织Notch/Hes蛋白定性:依据免疫组化结果,我们发现Notch-1为主要在细胞浆表达;Hes-1为主要在细胞浆/核表达;Hes-5为主要为细胞浆表达。Notch-1, Hes-1和Hes-5在胰腺局部的中性粒细胞、淋巴细胞、胰腺腺泡细胞等部位均有不同程度的表达;Notch-1,Hes-1和Hes-5在肺组织的中性粒细胞、淋巴细细胞等炎性细胞以及肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等部位也有不同程度的表达。表达强度和范围方面,胰腺和肺组织Notch/Hes蛋白表达强度与相应mRNA (Rt-PCR)的表达趋势基本一致。(9)胰腺组织Notch/Hes蛋白表达量:实验大鼠胰腺Notch/Hes蛋白相对表达量与mRNA相对表达量的变化趋势基本一致,其中模型Notch-1和模型Hes-5的蛋白表达趋势一致,而Hes-1和Hes-5的蛋白表达量则呈交替升降趋势。经过干预治疗后,治疗各组的Notch1蛋白表达量均较模型对照组增加,中剂量组和高剂量组效果相对显著(P<0.01);高剂量效果最好,显著优于低剂量组(P<0.05);高剂量组Hes1蛋白表达量显著高于模型对照组(P<0.01)、低剂量组(P<0.01)和高剂量组(P<0.05),而其余各组间Hes1的表达量则无显著统计学差异(P>0.05);中剂量组和高剂量组Hes-5量蛋白表达量均显著高于模型对照组(P<0.05),高剂量组蛋白表达量也较低剂量组显著增加(P<0.05),而其余各组间无显著统计学差异(P>0.05)。(10)肺组织Notch/Hes蛋白表达:实验大鼠肺组织Notch/Hes蛋白相对表达量与mRNA相对表达量的变化趋势基本一致,模型Hes-1和Hes-5表达量呈现交替升降趋势。经过干预治疗后,治疗各组Notch-1蛋白表达量均较模型对照组显著增加(P<0.05),其中高剂量组效果最显著(P<0.01),其余各组间均无显著统计学差异(P>0.05);治疗各组表达量均较模型对照组显著增加(P<0.05),高剂量组显著优于低剂量组(P<0.05),其余各组间均无显著统计学差异(P>0.05);中剂量组和高剂量组的Hes-5蛋白表达量均较模型对照组显著增加(P<0.05),高剂量组高剂量组显著优于低剂量组(P<0.05),其余各组间均无显著统计学差异(P>0.05)。结论:(1)逆行胰胆管注射牛磺胆酸法制作的动物模型基本符合SAP并发ALI的病理特点,适合该病理机制及药理等相关研究。(2)SAP并发ALI过程中,胰腺腺泡和肺组织细胞凋亡起着重要作用,且细胞凋亡与组织损伤程度呈显著负相关。SAP时胰腺细胞凋亡下降是病情恶化的重要原因之一;中性粒细胞凋亡的延迟或抑制是SAP并发ALI的重要机制。(3)Notch-1信号具有促进细胞凋亡的作用,SAP时Notch-1信号表达受限是胰腺局部和肺损伤症情恶化的重要因素。Notch/Hes信号对炎性细胞的凋亡具有促进作用,而对肺血管内皮细胞凋亡可能具有抑制作用,从而减轻肺部MPO水平、肺水肿及组织(胰腺和肺)损伤程度。(4)SAP并发ALI过程中,Hes-1和Hes-5在交替升降过程中维持一种稳态,从而对Notch-1信号具有反馈性放大作用。(5)大黄素具有明显抗SAP并发ALI的作用,包括降低血清淀粉酶水平,升高血清钙水平,降低肺组织MPO,改善肺水肿,从而降低胰腺和肺组织病理评分等。大黄素的作用呈剂量依懒性,高剂量组优势最显著。(6)大黄素不仅对SAP并发ALI模型的胰腺腺泡细胞,肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等自身组织细胞凋亡具有促进作用,更重要的是对组织间浸润的以中性粒细胞为代表的炎性细胞凋亡延迟(或抑制)现象具有治疗作用。(7)SAP并发ALI过程中,Notch/Hes信号通路是大黄素调控细胞凋亡的重要途径。大黄素不仅可以促进Notch-1mRNA和蛋白的表达,还可以促进其下游基因(Hes-1,5)mRNA和蛋白的表达,促使Notch信号放大,增强对细胞凋亡的调控作用,从而减轻SAP并发ALI时的组织病理损伤。