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胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是由胰高血糖素原基因翻译加工后产生,主要是由末端空肠、回肠和结肠的L细胞所分泌。GLP-1可以刺激胰岛素的分泌,促进胰岛β-cell的增值、胰岛的再生,抑制β-cell的凋亡,并且能够抑制肠胃排空,增加饱腹感从而减少饮食量；GLP-1的肠促胰岛素作用是葡萄糖依赖型的,治疗糖尿病时不会出现低血糖症状,这些功能使GLP-1作为一种治疗2型糖尿病的有效药物。本文从两个方面对胰高血糖素样肽-1进行研究。其一,针对目前研究主要集中在GLP-1(7-37),而GLP-1(1-37)调节血糖的功能尚不明确的问题,对GLP-1(1-37)的生物学活性进行研究。首先通过基因工程的方法构建了pET32a-GLP-1(1-37)表达载体,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,Ni离子亲和层析纯化得多肽GLP-1(1-37),然后在动物体内检测GLP-1(1-37)的降血糖活性及Exendin(9-39)对其降糖活性的影响；同时检测该多肽在动物血清中的稳定性及激动GLP-1受体(GLP-1R)的活性。其二,针对GLP-1在体内会迅速被二肽激酶Ⅳ降解,其半衰期短及口服利用率低的问题,在天然GLP-1的基础上对其结构进行改造,将Ala8突变为Ser8,Lys26突变为Gln26,Lys34突变为Asp34,Arg36突变为Thr36获得tGLP-1结构,将GLP-1的DPP-4和胰酶作用位点突变掉,以延长GLP-1的半衰期,从而抵抗DPP-4和胰蛋白酶的降解,使药物得以口服；同时采用基因串联表达的方法将tGLP-1基因串联,构建串联体重组表达载体以大量表达tGLP-1解决口服给药量大的问题；为了提高tGLP-1口服活性,制备了包裹tGLP-1的几丁质-聚谷氨酸(Chitin-PGA)微粒,并进行口服活性的检测。研究内容及结果如下：1.GLP-1(1-37)的克隆、表达与纯化以含有GLP-1(7-37)的质粒为模板,通过PCR在GLP-1(7-37)基因的上游引入GLP-1(1-6)序列以获得基因GLP-1(1-37),并将其插入到载体pET32a(+)中,成功构建了重组表达载体pET32a-GLP-1(1-37),经转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)获得基因工程表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET32a-GLP-1(1-37),IPTG诱导后表达GLP-1(1-37)融合蛋白,该蛋白主要以可溶性的形式存在,表达量达到30.74%,通过Ni离子亲和层析纯化获得融合蛋白,融合蛋白经肠激酶酶切后,再次Ni离子亲和层析,最终得到较纯的多肽GLP-1(1-37)。2.GLP-1(1-37)的性质研究正常昆明小鼠腹腔注射GLP-1(1-37)进行糖耐量实验,结果显示,GLP-1(1-37)能够显著改善小鼠的葡萄糖耐受性,2h内的平均血糖值与对照组相比,有极显著性差异(P<0.001)。按照高、中、低剂量(24nmol/kg、12nmol/kg、6nmol/kg)的糖耐量实验结果显示GLP-1(1-37)降血糖活性是剂量依赖性的。让人惊讶的是,检测GLP-1(1-37)对表达GLP-1R的人胚胎肾细胞中荧光素酶报告基因的表达的影响,结果证实GLP-1(1-37)可以激活GLP-1R,其ECso值仅为GLP-1(7-37)的1/10,说明GLP-1(1-37)是一种GLP-1R强激动剂(EC50=0.12nmol/L)。另外,当GLP-1(1-37)与GLP-1R拮抗剂Exendin (9-39)共同注射给小鼠时,GLP-1(1-37)的降血糖活性未被抑制,研究结果暗示GLP-1(1-37)可能通过不同机制激活GLP-1R而产生降血糖作用；通过反相液相色谱(HPLC)方法分析GLP-1(1-37)在血清中是稳定的,上述结果说明GLP-1(1-37)可能成为一种治疗2型糖尿病的药物。3.GLP-1衍生物tGLP-1串联体的构建比较几种GLP-1衍生物的口服活性,选出活性最好的tGLP-1,通过同尾酶串联的方法成功构建了1-8串tGLP-1串联体重组质粒,并且在E.coli中获得了表达。通过对八种表达质粒的稳定性及蛋白表达量的分析,选用质粒稳定性好、蛋白表达量高的四串tGLP-1(tGLP-1-C4)作为后续试验的材料。4. tGLP-1-C4融合蛋白的表达优化及可溶性鉴定从装瓶量、诱导时间、IPTG浓度、温度四个方面对IPTG诱导tGLP-1-C4的表达进行研究,结果得出最优的诱导表达条件为装瓶量30%,25℃振荡培养,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导6h。通过SDS-PAGE电泳发现tGLP-1-C4出现在沉淀中,说明是以包涵体形式存在的。5. Chitin-PGA包裹tGLP-1微粒的性质串联体蛋白tGLP-1-C4能够被胰酶切开产生小片段(即tGLP-1),检测tGLP-1-C4被胰酶作用前后小鼠体内的口服活性发现tGLP-1-C4只有被胰酶作用后才具有降血糖活性。比较tGLP-1-C4与天然GLP-1腹腔给药和口服给药时的活性,结果显示tGLP-1-C4比天然GLP-1的活性更好,药效时间明显延长。在此基础上,制备了包裹tGLP-1-C4的Chitin-PGA微粒,包裹率达到58%；给药剂量为400nmol/kg时,比较包裹前后的口服活性,结果显示tGLP-1包裹后药效时间达到了3h,用酪蛋白将微粒再次包裹后,药效时间达到4h,上述结果表明制备的药物微粒有望成为治疗糖尿病的口服药物。