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目的:探讨CVB3(Coxsackievirus B3)对Hela(Henrietta Lacks strain of cancer cells)细胞高尔基体及其细胞周期的影响,为研究CVB3的致病机制奠定基础。方法:将Hela细胞株作为敏感宿主细胞进行以下实验,用MOI(multiplicity of infection)为5的CVB3感染细胞:1、免疫荧光双标检测病毒感染后0 h、1.5 h、3 h、4.5 h和6 h等时间点VP1、GM130(Golgi matrix protein 130)和GRASP65(Golgi reassembly stacking protein 65)在细胞中的定位;2、选择CVB3感染0 h、1.5 h、3 h、4.5 h、6 h、7.5 h、9 h、10.5 h、12 h、13.5 h、15 h、16.5 h、18 h、21 h和24 h等时间点收集细胞,进行总蛋白定量后,Western Blot检测VP1、GM130和GRASP65蛋白的表达变化;3、分别选择G1/S期或G2/M期同步化细胞释放0 h、3 h、6 h和9 h等时间点,流式细胞仪检测CVB3病毒感染组与正常细胞组之间的细胞周期差异。结果:1、免疫荧光双标结果显示:(1)GM130和GRASP65的免疫荧光双标结果显示:GM130与GRASP65之间存在明显共定位,正常Hela细胞高尔基体位于近核区,高尔基带连续。(2)GM130和VP1的免疫荧光双标结果显示:正常细胞GM130免疫荧光呈带状分布,位于近核区;而自病毒感染3 h后,GM130的荧光在病毒感染细胞中出现散点状分布。(3)GRASP65和VP1的免疫荧光双标结果显示:正常细胞GRASP65免疫荧光呈带状分布,位于近核区;而自病毒感染3 h后,GRASP65的荧光开始出现较明显的弥散分布。2、Western blot结果显示:GM130的表达量自病毒感染后逐渐下降,至病毒感染18 h后未检测出GM130的表达;GRASP65的表达量变化趋势与GM130基本一致,但病毒感染12 h后即未检测出其表达;VP1的蛋白表达量自病毒感染开始即持续上升,6 h后一直维持在较高水平。3、流式细胞仪检测结果显示:(1)对胸苷双阻断法同步在G1/S期的细胞,释放0 h、3 h、6 h和9 h后,正常细胞组G1期的细胞比例分别是:89.14%、65.77%、14.14%和13.11%;而病毒感染细胞组G1期细胞比例分别是:91.08%、84.41%、81.81%和81.74%。(2)经诺考达唑(Nocodazole)作用后,G2期的细胞比例由非同步化状态时的4.62%上升到40%以上,表明诺考达唑已将部分细胞同步化G2/M期;同步化释放0 h、3 h、6 h和9 h后,正常细胞组G2期细胞比例分别是:42.99%、51.93%、37.97%和21.35%;而病毒感染细胞组G2期细胞比例分别是:61.25%、43.34%、29.37%和27.62%,与此同时G1期细胞比例分别是:8.48%、28.01%、28.10%和33.46%。结论:1、CVB3感染引起Hela细胞高尔基带断裂,高尔基体结构受到影响。这可能是CVB3感染导致宿主细胞病变效应的机制之一。2、CVB3感染下调了GM130和GRASP65的表达。GM130和GRASP65的蛋白表达下降可能是高尔基体结构破坏的机制之一。3、CVB3感染G1/S期细胞后,细胞周期主要停滞在G1期,但CVB3并不阻滞G2期细胞。