论文部分内容阅读
抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子物质,是生物天然免疫反应系统的重要成员,在生物体抵抗外界病原感染过程中起着非常重要的作用。抗菌肽分布十分广泛,并且对大多数革兰氏阴性或阳性菌、真菌、原生动物都有抑制作用,有些抗菌肽还具有抗寄生虫、病毒和肿瘤的作用。本研究根据本实验室构建的黄鳝肠道cDNA文库中获得的抗菌肽hepcidin基因ORF区(GenBank登陆号：GU997139)设计并合成特异性引物,利用RT-PCR技术从黄鳝肠道总RNA中扩增出一条约300bp的目的基因片段。将目的基因片段克隆到pMD18-T载体上,序列测定结果表明与hepcidin基因ORF区完全一致。序列分析表明：该基因ORF区长273bp,编码90个氨基酸,分子量约10236Da,包括24个氨基酸的信号肽、40个氨基酸的前域和26个氨基酸的成熟肽。结构预测显示其属于β-折叠类抗菌肽,包含有hepcidin类抗菌肽典型的8个半胱氨酸结构,形成4对二硫键。利用氨基酸序列进行同源比对,发现黄鳝抗菌肽hepcidin与多种肉食性鱼类的抗菌肽hepcidin同源性较高,其中与大黄鱼的同源性最高,为81%。分别设计带限制性内切酶BamH I和Hind III酶切位点的特异性上、下游引物,以pMD18-T-hepcidin阳性克隆质粒为模板,亚克隆黄鳝抗菌肽hepcidin基因完整的ORF区(s-hepcidin)和不含信号肽的hepcidin基因(n-hepcidin)编码序列,并插入原核表达载体pET32a(+),构建重组原核表达质粒pET32a(+)-s-hepcidin和pET32a(+)-n-hepcidin。分别转化至大肠杆菌BL21 (DE3) pLysS,在37℃,1mM IPTG诱导表达4h后,经SDS-PAGE电泳鉴定分析,pET32a(+)-s-hepcidin阳性重组菌没有表达出预期的目的蛋白；而pET32a(+)-n-hepcidin阳性重组菌明显表达出目的融合蛋白,大小约为28KDa,与预期目的融合蛋白分子量大小一致。对pET32a(+)-n-hepcidin在BL21 (DE3) pLysS中的诱导表达进行IPTG浓度和表达时间优化,发现IPTG诱导浓度在0.1mM时表达量最大,而最佳诱导时间为4h。在最佳表达条件下,pET32a (+)-n-hepcidin重组蛋白在BL21 (DE3) pLysS表达菌株中为可溶表达。