研究背景世界范围内,由创伤、肿瘤和感染等原因引起的骨缺损正逐年增加,对人们的健康产生越来越大的影响。在我国,由于骨缺损而需要接受治疗的患者每年大约有400万。除了疾病引起的骨缺损需要骨移植外,整形美容外科手术中也经常需要骨移植来塑形[1]。骨移植材料已成为仅次于输血的需求量最大的移植物,而且有逐年增多的趋势。迄今为止,自体骨移植作为金标准广泛应用于临床,但是其存在来源有限和供区功能缺失的问题,并且取骨的过程会造成患者持续疼痛、神经损伤和新的骨折等,限制其临床应用;同种异体骨因存在免疫反应和传播疾病的危险,也限制其在临床的应用。因此,研制理想的骨移植物修复骨缺损成为医学和生物材料科学领域中的重要课题。理想的骨移植材料应该具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性和骨诱导性[2]。在过去的10年间,研究的热点集中在骨移植材料的设计和体内外应用上,已有许多研究者研发了多种骨修复材料。天然骨主要由磷灰石和胶原组成。因此,由羟基磷灰石和胶原组成的骨修复材料研究广泛。通过自组装的方法,清华大学的崔福斋教授课题组研制出一种新型的纳米羟基磷灰石/胶原(nHAC)材料。通过实验表明,该材料无论是在结构上,还是在成分上,可以媲美天然骨组织。Nature Materials曾发表评论:崔教授课题组的工作是具有开创性的工作。他们找到了用仿生自组装制造生物材料的新方法。同时,骨矿化胶原的分级结构理论在实验中得到证实。聚乳酸(PLLA)具有无毒性和可降解性,被广泛应用于骨组织工程支架材料的研究,并被美国食品与药品管理局(FDA)批准广泛用作手术缝合线、体内支架,并可以作为药物控释载体[1]。由nHAC和PLLA构成的新型骨组织工程材料nHAC/PLLA已成功制备。其构成和分级的微观结构都类似天然骨组织,可以提高细胞的粘附力、刺激细胞增殖和分布。自2011年被食品和药品监督局批准注册证以来,临床已应用上万例,临床数据显示其具有广阔的临床应用价值。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMPs)最早由Urist发现并命名。BMPs是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白,属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族。近些年的研究发现,BMPs有多种生物学功能。其最为研究者关注的功能为其能够在体内诱导骨和软骨形成。无论是在肢体生长、软骨内骨化等生理状态下,还是在骨折后修复、软骨损伤后修复等病理状态下,均可表达。在骨骼的胚胎发育以及骨折后的修复中均起到重要作用。BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMPs之一。天然的BMP-2虽然具有较强的诱导成骨的能力,但存在数量有限,价格较高等问题。临床上通过载体负载应用BMP-2,在和载体负载后,带来很多问题。例如,分子的活性在有些情况下会受到干扰。如大分子蛋白质吸附在材料表面后会随机折迭,使活性位点难以暴露,降低其生物活性;另外,难以持续,缓慢释放。在生物环境中早期突释,随后浓度迅速下降,达到治疗水平以下,作用时间短暂。经过美国FDA认证的重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)在工艺,质控,安全性方面还存在各种问题,无法大规模的生产[3]。清华大学材料科学与工程学院生物材料组组根据BMP2的活性核苷酸序列,用化学合成法合成含有17个氨基酸的新型短肽P17-BMP-2。该短肽克服了国内外基因工程技术制备的rhBMP-2的缺点。其与BMP2的骨诱导活性相类似,同时应用了固相合成法,工艺更为简单,可以用多肽合成仪大量制备。解决了 rhBMP-2无法大规模生产以及安全性的难题。P17-BMP-2仅含有17个氨基酸,可以有效地克服大分子所带来的抗原性以及其他一些生物副作用。结构简单,生物性状更加稳定,活性更好。而且,非常方便对该肽链进行修饰。可以说,该核苷酸序列继承了 BMP-2的活性,克服了其缺点。因此,本课题将清华大学馈赠的新型短肽P17-BMP-2与高诱导性胶原基纳米羟基磷灰石骨材料(nHAC/PLLA)复合,通过体外细胞实验,研究新型短肽P17-BMP-2体外诱导成骨能力,及将其负载到nHAC/PLLA上后,通过动物实验,研究该种新材料在促进骨缺损修复过程中的作用及变化,为其临床应用提供实验数据和理论依据。研究目的1.利用固相多肽合成法合成含有17个氨基酸的新型短肽P17-BMP-2.2.研究P17-BMP-2的诱导成骨的能力3.利用吸附法将短肽P17-BMP-2负载于胶原基纳米羟基磷灰石复合材料中(nHAC/PLLA)。4.检测负载P17-BMP-2短肽的材料的体外控释效果。5.通过体外细胞实验和兔体内植入实验验证负载P17-BMP-2短肽的材料的体内外诱导成骨能力。研究方法1新型短肽P17-BMP-2的制备首先通过固相多肽合成法(FMOC/tBU)合成粗肽。通过凝胶过滤层析初步纯化粗肽,通过高效液相色谱法再次纯化,最后由质谱仪检测确定短肽序列。2 P17-BMP-2体外诱导活性实验取培养第2、3周细胞,根据碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒,检测各组AKP的含量。3.新型短肽P17-BMP2与支架材料nHAC/PLLA的复合扫描电镜,透射电镜下观察支架材料nHAC/PLLA无菌条件下,将P17-BMP-2溶于去离子水,调节到所需浓度(2mg/ml和10mg/ml)。纳米羟基磷灰石/胶原/聚乳酸材料(nHAC/PLLA)(5×5×5mm)分别浸渍到P17-BMP-2溶液,轻轻搅拌2小时200rpm。真空干燥,烘干、冷冻、消毒。4.将p17-bmp-2负载于nHAC/PLLA,同种异体骨,可吸收胶原蛋白海绵,应用BCA蛋白浓度测定试剂盒,比较缓释活性。5.复合短肽nHAC/PLLA上培养细胞的活性检测将鼠MSC种植于各组材料上,分别于种植2、4、6天后,通过MTT法检测各组材料上鼠MSC的增殖情况。细胞PI染色,激光共聚焦检测细胞增殖情况。6动物实验所有实验动物随机分为四组,每组5只:A:空白对照不植入材料,B:nHAC/PLLA,C:nHAC/PLLA/P17-BMP-2(2mg/g),D:nHAC/PLLA/P17-BMP-2(10mg/g)。在下颌体制备极限骨缺损(10mm×5mm×5mm)的非贯穿骨缺损,保留颊舌侧骨皮质。7影像学分析取术后2,4周不同时期的动物标本,行X线检查。根据Lane-SandhuX线评分标准法,对骨愈合过程中的骨痴量、骨连接、骨塑形等情况进行综合评分,客观评估新骨形成的情况。8组织学分析骨材料分别在植入后2,4周处死动物,完整取下术区下颌骨,4℃固定于含有4%的多聚甲醛和0.2%苦味酸,pH= 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中7天,并在pH=7.5,20%EDTA溶液中脱钙8周,后流水冲洗12h以上。经过脱水、透明,石蜡包埋后,连续切取5μm组织片10张,进行组织学染色(H.E.)。采用Lane and Sandhu开发的组织学评分系统进行统计学处理。研究结果1.高压液相色谱仪显示合成肽的纯度为96%,质谱图显示合成肽的平均分子量为2023.67m/z,与理论上设计多肽的平均分子量一致,短肽序列正确,满足实验需求。2.碱性磷酸酶结果显示:随时间延长,各组材料中碱性磷酸酶含量逐渐增高。在第2周和第3周时,含有10ug/ml新型短肽材料略低于阳性对照组。各实验组碱性磷酸酶含量明显高于阴性对照组。同一时间点,含有30ug/mlP17-BMP-2的材料组碱性磷酸酶含量明显优于其他组。3.电镜观察nHAC/PLLA,可见不规则排列的孔隙结构4.P17-BMP-2负载于nHAC/PLLA,缓释效果优于同种异体骨5.MTT结果显示各组材料随着时间的推移细胞数量逐渐增加,活性增强。含有10mg/g短肽P17-BMP-2的材料组细胞活性最强。细胞染色后,激光共聚焦检测显示10mg/g短肽P17-BMP-2的材料组细胞活性最强。6.影像学分析结果显示:术后2周时,空白对照组未见有骨密度影形成,植入骨修复材料组均可见低密度影形成,且复合新型短肽的材料组密度影比对空白对照组和单纯材料组密度影要深。术后4周,各组密度影都比术后2周时加深,并且面积增大。空白对照组密度影加深但是不连续。复合新型短肽含量高的密度影最深面积基本完全充满缺损部位。根据Lane-Sandhu X射线评分标准计算结果显示术后4周的分值明显高于术后2周。且随着复合新型短肽P17-BMP-2的含量的增多其分值越高。7.组织学分析结果显示:术后2周,A组(空白对照组)在缺损区边缘处有纤维结合,见成纤维细胞形成。B组(单纯材料组)可见兔宿主骨组织与植入材料结合部位开始模糊,有纤维连接,大量结缔组织形成。并且结缔组织、成纤维细胞长入材料深部,但未长满材料。材料与宿主骨交界处可见小血管形成,炎性细胞浸润材料。材料有轻微降解。C组和D组(植入复合新型短肽P17-BMP-2的材料组),可见有大量炎性细胞浸润,成纤维细胞、结缔组织形成,纤维连接更明显,有大量小血管生成和骨母细胞长入,随着新型短肽含量增多可见有早期骨形成和活跃的新骨化组织形成,可见材料有轻微降解。术后4周,A组(空白对照组),可见明显纤维连接,有活跃的新骨形成。B组(植入nHAC/PLLA材料组)有少量炎性反应,结缔组织,大量纤维连接在宿主骨与植入材料交界处形成,有大量小血管形成,并且有活跃的新骨形成,少量骨聚集。可见材料明显降解。C组和D组(植入复合新型短肽P17-BMP-2的材料组)可见炎性细胞浸润比2周时明显减少,有大量活跃的新骨形成,并且随着新型短肽含量增多新骨形成增多,并且新骨聚集形成新的骨化结构。宿主骨与新形成的骨形成连接界限模糊,可见早期皮质骨形成。可见植入材料明显降解。根据Lane-Sandhu组织学评分标准计算分析结果显示,术后4周骨缺损修复显著优于术后2周时的修复,组织学评分均值差异,有统计学意义(p<0.001)。术后4周,D组骨缺损修复明显优于其他各组。结论1利用固相多肽合成法合成含有17个氨基酸的新型短肽P17-BMP-2,序列正确。2新型短肽P17-BMP-2体外具有促进鼠MSC增殖的活性并且诱导鼠MSC分化成骨。3.P17-BMP-2负载于nHAC/PLLA有较好的缓释效果。4.nHAC/PLLA与新型短肽P17-BMP-2复合后能有加速诱导骨修复,可以为其临床应用提供实验数据和理论支持。