论文部分内容阅读
本次研究主要通过动物实验,探讨注射用心肌肽对幼大鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。第一部分幼鼠离体心脏Langendorff灌流模型的建立及注射用心肌肽对幼鼠离体心脏的心功能影响目的:1建立稳定的幼大鼠离体心脏Langendorff灌流模型,2.观察注射用心肌肽对幼大鼠不同状态下的离体心脏心功能的影响。方法: 50只SD幼鼠,随机分为5组,每组10只,离体心脏用Langendorff灌流、灌流用K-H缓冲液,正常对照组:心脏稳定20min后,再持续灌注150min;正常+注射用心肌肽组:同正常对照组、但在灌流液中加入注射用心肌肽50 mg/L;缺血再灌注损伤模型组分3组:心脏稳定20min后,停跳液灌三次使心脏停搏(缺血)90min,再恢复正常灌流(再灌注)60min,建立心肌缺血再灌注损伤模型,对照组(Control):灌流用K-H缓冲液、停搏用ST.Thomas’II停搏液,注射用心肌肽用药两组(CMP1组:停搏液加入注射用心肌肽100 mg/L;CMP2组:灌流液加入注射用心肌肽50 mg/L及停搏液加入注射用心肌肽100 mg/L)。监测不同组离体灌流心脏心率(HR,min-1)、收缩力(△T,g)及最大收缩速度(+dT/dtmax,g.s-1)和最大舒张速度(-dT/dtmax,g.s-1)、冠脉流量(CF,ml.min-1)、复跳时间(s)反映心功能,结果:正常对照组离体心脏长时间灌流后心功能无明显变化,正常+注射用心肌肽组的心功能也无明显变化。停搏再灌流后,对照组心搏功能下降,冠脉流量减少,而两个用药组心搏功能仅轻微下降,冠脉流量减少较轻,且停跳液和灌流液中均加入注射用心肌肽的离体心脏的心功能更佳。结论:幼鼠离体心脏Langendorff灌流模型的性能稳定,可用于下一步的实验研究。注射用心肌肽对正常心脏心功能无明显影响。注射用心肌肽可改善缺血心脏再灌注后的冠脉流量,提高心功能,对幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤可能具有保护作用。第二部分注射用心肌肽对幼鼠离体未成熟心肌缺血再灌注损伤保护作用及机制目的:探讨注射用心肌肽对幼鼠离体灌流的心脏缺血再灌注损伤有无保护作用及机制。方法: 30只SD幼鼠,随机分为3组,每组10只,离体心脏用Langendorff灌流、灌流用K-H缓冲液,停搏用ST.Thomas’II停跳液;心脏稳定20min后,停搏液停搏(缺血)90min,再恢复正常灌流(再灌注)60min,建立心肌缺血再灌注损伤模型,对照组(Control):灌流用K-H液、停搏用ST.Thomas’II停跳液,注射用心肌肽用药两组(CMP1组:停跳液加入注射用心肌肽100 mg/L;CMP2组:灌流液加入注射用心肌肽50 mg/L及停跳液加入注射用心肌肽100 mg/L)。监测离体灌流心脏的心功能、包括心率(HR,min-1)、收缩力(△T,g)及最大收缩速度(+dT/dtmax,g.s-1)和最大舒张速度(-dT/dtmax,g.s-1)、冠脉流量(CF,ml.min-1)、复搏时间(s),检测冠脉流出液中肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量的变化,实验结束、取心尖部的心肌组织、光镜及透射电镜观察缺血再灌注损伤模型组中幼鼠心肌组织超微结构改变,生化检测心肌组织能量指标的变化,心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛、NO的含量,检测心肌组织NOS、醛糖还原酶的活性,实时荧光定量PCR相对定量检测心肌组织iNOSmRNA、eNOSmRNA和Akr1b4 mRNA表达。结果:。停搏再灌流后,对照组心搏功能下降,冠脉流量减少;而两个用药组心搏功能仅轻微下降,冠脉流量减少较轻。电镜观察可见对照组心肌肌原纤维断裂,线粒体肿胀,而用药组心肌组织结构较完整,线粒体未见明显肿胀变性。再灌注后,对照组CK-MB增加。与对照组比较,两个用药组的CK-MB含量低,Na+-K+ ATP酶、Ca2+-Mg2+ ATP酶、心肌总ATP酶活性相对较高,SOD活性也增高,丙二醛、NO含量低,心肌组织NOS、醛糖还原酶的活性下降,iNOS、Akr1b4 mRNA表达下调,其中CMP2组改变更为明显(P<0.01或P<0.05)。此外eNOS mRNA表达在CMP2组有升高(P<0.05),而在CMP1组中变化无统计学意义。结论:注射用心肌肽可改善缺血心脏再灌注后的能量代谢,增加冠脉流量,提高心功能,对幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,其作用机制可能与抑制心肌细胞iNOS, Akr1b4 mRNA表达,减少NO生成,抑制醛糖还原酶的活性有关。停跳液和灌流液中均加入注射用心肌肽对未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用效果更佳。第三部分注射用心肌肽预处理减轻大鼠未成熟心肌缺血-再灌注损伤目的:探讨注射用心肌肽预处理对幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其相应的作用机制。方法:30只SD幼鼠,随机分为3组,每组10只,通过结扎幼鼠冠状动脉左前降支建立缺血再灌注动物模型,分为假手术组、缺血再灌注组和注射用心肌肽组,全自动生化仪检测血清酶学LDH、CK-MB、Elisa法检测血清肌钙蛋白Tn-T,生化检测心肌组织匀浆MDA、SOD、TNOS、iNOS、eNOS含量变化,免疫组化法检测NOS2(iNOS)、NOS3(eNOS)含量变化,光学显微镜观察心肌梗死范围和透射电镜检测心肌组织结构改变,TUNEL法观察心肌凋亡细胞,免疫组化法检测活性Caspase-3蛋白表达水平以及应用实时荧光定量PCR分析心肌组织iNOS、eNOS、Caspas-3 mRNA表达变化。结果:注射用心肌肽组LDH、CK-MB、Tn-T的浓度低于缺血再灌注组,MDA、TNOS、iNOS含量以及Caspase-3、iNOSmRNA表达水平较假手术组增高,但低于缺血再灌注组,SOD的活性高于缺血再灌注组(P<0.01或P<0.05),差异有统计学意义。缺血再灌注组心肌片状出血、炎性细胞浸润,心肌细胞严变性坏死,心肌细胞凋亡显著;而注射用心肌肽组心肌梗死范围小于缺血再灌注组,心肌细胞变性坏死程度较轻,血管结构正常,心肌凋亡细胞水平介于假手术组和缺血再灌注组之间。结论:注射用心肌肽预处理可以减轻幼鼠未成熟心肌缺血再灌注损伤、对未成熟心肌具有保护作用,其作用机制可能与减少氧自由基损伤及减少NO生成,抑制心肌细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达,从而减少细胞凋亡有关。