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启动子在基因表达调控中起着不可替代的重要作用,是最重要的表达调控元件之一。目前在酿酒酵母中常用的天然启动子通常分为组成型启动子和诱导型启动子。但天然启动子的表达强度相对有限,即使是目前报道的最强的启动子常常也达不到研究的需求;此外,诱导型启动子通常需要诱导剂的添加,而可以自动响应生长状态的变化而诱导基因表达的启动子的研究也较少,不能满足代谢工程及合成生物学的需求,因此,对启动子的研究和改造对于人们更好的调节基因的表达具有重要的意义。为了解决这些问题,我们的工作主要从以下两个方面展开:1、组成型杂合启动子的构建与分析天然组成型启动子,即使是最强的启动子如TEF1启动子等也常常不能满足表达的需求,且常用的启动子的表达强度的范围较窄,因此,我们利用上游激活元件(Upstream Activation Sequence,UAS)的串联,和核心元件的调试,构建了一系列具有不同启动强度的杂合启动子。首先,我们选取了 10个来源于组成型启动子的UAS元件,与CYC1启动子来源的核心元件组装,利用黄色荧光蛋白作为报告基因检测启动子的转录强度。通过荧光测定,选取出表达强度较高的UAS元件 UASYEF3,UASTEF1,UASENO2,UASTpI1 和 UASTDH3。然后,再将筛选出的UAS元件进行杂合组装,或者将相同UAS元件进行串联。荧光测定发现,两个UAS串联或组合后,绝大多数启动子的转录能力都有了明显的提高,但是三个UAS串联或组合后,只有UASENO2的串联重复,进一步提高了启动子的启动强度,其他UAS的串联或组合,均未使启动子的强度进一步提高,这可能与UAS和转录起始位点的距离有关,但具体原因还需要进一步分析。接下来,我们选取了 4个启动子的核心元件,包括PTEF1,PTDH3,PGAL1和PCYC1,与UASENO2进行组装,测定发现PTEF1核心元件具有最高的转录强度。因此,我们将启动强度较高的杂合启动子的核心元件替换为PTEF1。荧光结果显示,替换核心元件后,这些杂合启动子的启动强度都有了进一步的提高,提高幅度大约为1倍。其中,杂合启动子UASENO2-PTEF1具有最高的启动强度,大约是之前文献构建的强杂合启动子p41 6mcstefcit3x的1.4倍,为目前报告的最强的杂合启动子之一。2、生长状态自动调控杂合启动子的构建与分析当表达具有毒性的蛋白,或者一些途径的持续表达会对细胞生长造成负担时,则不能选择组成型表达的方式,需要先维持细胞生长,待细胞生长到一定程度后,再启动相关基因的表达,这时通常需要利用诱导型启动子来实现调控。但是,常用的诱导型启动子需要诱导剂的添加,增加了生产成本,不利于真正工业应用。而受生长状态调控的自动诱导型启动子,在无需添加任何诱导物的条件下,可感应细胞的生长状态自动启动表达,从而实现细胞增殖与产物积累的分开。但目前天然的受生长状态调控的自动诱导型启动子即使在诱导条件下,转录能力也弱于组成型启动子,这限制了其广泛应用。本节研究选取了受葡萄糖抑制的启动子PHXK1,PM4AL32的UAS元件,低pH值响应的启动子PCWP2的UAS元件,以及热激胁迫响应的启动子PSSA1,PSSA3和PHSP30的UAS元件,与CYC1启动子的核心元件组装,构建杂合启动子。其中,UASHSP30-Pcyc1、UASMAL32-PCYC1和UASSSA3-PCYC1启动子在葡萄糖存在时,也就是细胞生长旺盛的对数期,受到抑制,转录活力很低,甚至低于PCYC1核心元件;但当葡萄糖耗尽,细胞进入二次生长期后,转录活力显著增强,提高了 2-6倍。UASSSA1-PCYC1的转录活性在细胞生长的后期也比指数生长期强,不过其指数生长期的本底转录活力也相对较高(高于PCYC1)。为进一步提高这些启动子的强度,我们将核心启动子替换为PTEF1的核心元件,发现,这些启动子的转录活力又进一步提高2-3倍。其中UASSSA1-PTEF1的转录活力最高,与UASTPI1-Pcyc1 相当。而 UASHSP30-PTEF1 和 UASMAL32-PTEF1启动子的转录活性在细胞生长的后期比指数生长期提高了 3-6倍,实现了感应细胞生长状态,自动诱导的高效表达。综上所述,通过串联UAS元件以及替换核心元件的组装策略,我们构建了两类杂合启动子:组成型杂合启动子和生长状态自动调控杂合启动子。这些启动子的构建不仅丰富了目前启动子的启动强度,而且生长状态自动诱导型杂合启动子的构建,也为需要生长阶段控制的表达调控的实现,提供了可能。