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CpG-ODN是一些发现于细菌中含有未甲基化的CpG二核苷酸对并且具有免疫激活作用的寡核苷酸。大量研究已证明CpG-ODN具有直接激活B细胞增殖、促进树突状细胞成熟及诱导抗原呈递细胞分泌多种细胞因子等作用。应用基础方面的研究表明CpG-ODN可以作为一类新型的免疫佐剂在抗肿瘤、抗感染和防治哮喘等方面具有非常乐观的应用前景。鉴于CpG-ODN广泛的免疫调节作用及应用潜力,对其细胞内分子作用机制的研究成为当前的一个热点,而焦点问题是寻找免疫细胞上CpG-ODN的特异性识别受体并阐明其信号跨膜传递的机制。 最近的研究发现CpG-ODN的特异性识别受体极可能是Toll-Like-Receptors(TLRs)家族的新成员——TLR9,证据主要来自基因敲除小鼠,即如果将TLR9或TLR家族共用的下游信号分子的接头分子——MyD88的基因敲除后,则基因敲除小鼠的免疫细胞就失去了对CpG-ODN刺激的应答性,而且TLR9是一种膜蛋白,其胞外部分含有与甲基化CpG-DNA结合蛋白MBD-1-4同源的DNA结合域,这提示CpG-ODN系与TLR9结合之后再通过接头分子MyD88向内传递激活信号。但令人困惑的是目前一直未能直接观察到TLR9与CpG-ODN的特异性相互作用,而且免疫细胞膜上并不存在CpG-ODN的特异性结合位点。尽管ODN能与细胞膜结合,但这些结合均没有CpG序列的特异性,而且证据表明免疫细胞对CpG-ODN的特异性识别及信号触发不是发生于细胞外膜上,而是继发于CpG-ODN被细胞内吞和内体酸化之后。据此我们推测:如果TLR9的确是CpG-ODN的特异性受体,则TLR9与CpG-ODN的特异性结合及相关激活信号的触发极有可能发生于CpG-ODN被内吞之后的酸性内体中,而不是发生于细胞外膜上。亦即TLR9与CpG-ODN的特异性结合极有可能需要一个特定的外在条件即偏酸性的pH环境。 为证实上述推测,我们在研究中比较了不同pH条件下CpG-ODN与细胞膜的结合及其免疫调节活性,发现:在中性pH条件下ODNs与免疫细胞膜的结合的确没有序列选择性,但在偏酸性pH条件却能观察到CpG-ODN与免疫细胞膜有特异性结合,而且在微偏酸条件下,免疫细胞对CpG-ODN的刺激更加敏感。另外,我们以RT-PCR方法从小鼠脾细胞mRNA中扩增出TLR9基因,将胞外区亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体,转入COS7细胞瞬时表达,表达产物可被抗小鼠TLR9