【目的】对比剂引起的急性肾损伤（contrast-induced acute kidney injury,CI-AKI）已成为院内获得性急性肾损伤的重要原因,其主要病理改变为肾脏小管上皮细胞损伤。目前研究发现炎症反应参与了CI-AKI的进程。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain[NOD]-like receptor protein 3,NLRP3）是固有免疫的重要受体,在多种肾脏固有细胞如小管上皮细胞、系膜细胞和足细胞上均有表达,受外界刺激活化可后与凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC）结合形成NLRP3炎症体,进一步活化半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）,引起白介素18（Interleukin-18 IL-18）与白介素1β（Interleukin-1βIL-1β）的成熟与释放,参与炎症反应。本文拟探讨:1.对比剂对正常人肾小管上皮细胞的影响。2.NLRP3炎症体在对比剂损伤HK-2细胞过程中的作用。3.制备CI-AKI小鼠模型。4.NLRP3基因在小鼠CI-AKI模型中的作用。【方法】1.培养人肾小管上皮细胞（Human Kidney-2 HK-2）。实验分为:1、正常对照组;2、欧乃派克组;3、威视派克组;4、甘露醇组。通过CCK-8法检测HK-2细胞活性;real time-PCR与Western Blot技术检测对比剂刺激后NLRP3和ASC mRNA与蛋白水平的变化;流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况。2.培养人肾小管上皮细胞（HK-2 cell）。实验分为:1.正常对照组;2.欧乃派克组;3.甘露醇组。运用siRNA沉默NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3与ASC。通过real time-PCR检验siRNA沉默靶基因的效果;流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;Western Blot技术检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8、caspase-9/cleaved caspase-9水平与NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、ASC、caspase-1/cleaved caspase-1水平变化,ELISA检测细胞上清中IL-1β与IL-18含量变化。3.结合文献综合考虑后,我们引入单侧肾切除、脱水与尾静脉注射速尿作为预处理方法。本部分实验设计了如下造模方法,尝试寻找合适的CI-AKI小鼠模型:8周龄20g左右雄性C57BL/6小鼠54只,除对照组外均行单侧肾切除,正常饲养四周后分组:1、对照组（组1）;2、速尿组:尾静脉注射10ul/g速尿（组2）;3、速尿+对比剂组:尾静脉注射10ul/g速尿,20min后注射欧乃派克10ul/g（组3）;4、24h脱水+速尿组:禁水24h后尾静脉注射10ul/g速尿（组4）;5、24h脱水+速尿+对比剂组:禁水24h后尾静脉注射10ul/g速尿,20min后注射欧乃派克10ul/g（组5）;6、48h脱水+速尿组:禁水48h后尾静脉注射10ul/g速尿（组6）;7、48h脱水+速尿+对比剂组:禁水48h后尾静脉注射10ul/g速尿,20min后注射欧乃派克10ul/g（组7）;8、72h脱水+速尿组:禁水72h后尾静脉注射10ul/g速尿（组8）;9、72h脱水+速尿+对比剂组:禁水72h后尾静脉注射10ul/g速尿,20min后注射欧乃派克10ul/g（组9）。造模24h后处死小鼠,检测小鼠血清肌酐含量变化。4.引入NLRP3^-/-小鼠,以雄性C57BL/6小鼠作为对照。选用18只8周龄雄性NLRP3^-/-小鼠+18只8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠,实验分组:1、WideTpye对照组;2、Widetype预处理组:小鼠行单侧肾切除,正常饲养四周,禁水24h,速尿10ul/g尾静脉注射;3、Widetype造模组:小鼠行单侧肾切除,正常饲养四周,禁水24h,速尿10ul/g尾静脉注射,20min后欧乃派克尾静脉注射（10ul/g）;4、NLRP3-/-对照组:正常喂养。5、NLRP3^-/-预处理组:小鼠行单侧肾切除,正常饲养四周,禁水24h,速尿10ul/g尾静脉注射;6、NLRP3^-/-造模组:小鼠行单侧肾切除,正常饲养四周,禁水24h,速尿10ul/g尾静脉注射,20min后欧乃派克尾静脉注射（10ul/g）。通过HE染色观察肾脏结构变化;westernblot技术检测小鼠肾组织中凋亡相关蛋白与NLRP3炎症体相关蛋白含量含量变化;Tunel染色检测细胞凋亡;免疫组化检测NLRP3炎症体相关蛋白表达。【结果】1.低渗对比剂欧乃派克与等渗对比剂威视派克均可诱导HK-2细胞活力下降（p<0.05）,仅有欧乃派克刺激HK-2细胞后导致NLRP3、ASC mRNA与蛋白水平升高（p<0.05）。欧乃派克可诱导HK-2细胞凋亡（p<0.05）。2.RNA干扰降低HK-2细胞内NLRP3 mRNA与ASC mRNA水平,欧乃派克可诱导HK-2细胞中NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1,细胞上清中IL-18与IL-1β蛋白水平升高,沉默NLRP3基因或ASC基因抑制炎症体活化。欧乃派克诱导HK-2凋亡;诱导HK-2细胞中促凋亡蛋白BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8水平显著升高（p<0.05）。抑凋亡蛋白BCL-2水平显著下降（p<0.05）。沉默NLRP3或ASC基因减轻欧乃派克诱导的HK-2凋亡;减轻细胞中促凋亡蛋白BAX、caspase-3/cleaved caspase-3、caspase-8/cleaved caspase-8水平升高（p<0.05）及抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）。3.与对照组相比,速尿+对比剂组、脱水24h+速尿组、脱水24h+速尿+对比剂组、脱水48h+速尿组、脱水48h+速尿+对比剂组、脱水72h+速尿组、脱水72h+速尿+对比剂组血清肌酐显著升高（p<0.05,p<0.01）。与脱水24h+速尿组相比,脱水24h+速尿+对比剂组肌酐显著升高（p<0.05）;脱水48h+速尿组与脱水48h+速尿+对比剂组相比,肌酐无显著差异（p>0.05）;脱水72h+速尿组与脱水72h+速尿+对比剂组相比,肌酐无显著差异（p>0.05）。4.Widetype造模组小鼠肾组织中NLRP3炎症体相关蛋白NLRP3、ASC、cleaved caspase-1水平升高（p<0.05）;促凋亡蛋白BAX、cleaved caspase-3水平升高（p<0.05）。抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）;肾脏皮髓交界处细胞凋亡（p<0.05）,肾脏小管损伤,结构破坏（p<0.05）。NLRP3^-/-小鼠肾组织中的NLRP3炎症体通路被阻断。与Widetype造模组相比,NLRP3^-/-造模组可减轻肾组织中促凋亡蛋白BAX、cleaved caspase-3水平升高（p<0.05）与抑凋亡蛋白BCL-2水平降低（p<0.05）;NLRP3^-/-造模组肾脏皮髓交界处细胞凋亡较Widetype造模组减轻（p<0.01）;肾小管损伤较Widetype造模组减轻（p<0.01）。【结论】1.对比剂可活化HK-2细胞中NLRP3炎症体。2.低渗对比剂欧乃派克可诱导HK-2细胞凋亡,阻断NLRP3炎症体通路可减轻对比剂引起的细胞凋亡。3.单侧肾切除+脱水24h+速尿10ul/g+欧乃派克是一种较好的低渗对比剂造CI-AKI小鼠模型的方法。4.NLRP3^-/-小鼠可更好地抵御CI-AKI引起的肾脏损伤。