血管可以给机体内的细胞提供氧和营养物质，所以每个细胞距离血管不超过100μm～200μm，这是氧自由扩散的最大距离。直径超过100μm～200μm的器官必需通过血管发生和(或)血管形成来构建新血管以提供氧和营养物质。新生血管的形成受促血管形成因子和抑血管形成因子的调控，可见于多种疾病病理过程中，特别是在肿瘤的发生和发展过程起着非常重要的作用。肿瘤血管形成是指在以上两类调控因子平衡被打破的情况下，局部血管基底膜降解，内皮细胞增殖、迁徙并重排，通过出芽和(或)套叠的方式形成新生血管的过程。肿瘤中血管发生是指肿瘤细胞吸引骨髓中血管内皮祖细胞至肿瘤组织参与新生血管形成。一旦肿瘤组织中有新生血管形成，肿瘤迅速增长并且增加肿瘤转移的可能性。 肿瘤转移是肿瘤死亡率高居不下的重要原因之一，因为目前对于多发性的肿瘤转移尚无有效的治疗方法。虽然对肿瘤诊疗方法有了长足进步，但是某些肿瘤的生存率并没有明显提高，其主要原因是患者就诊时肿瘤就已经扩散、转移。鉴于肿瘤的生长和转移都具有血管依赖性，从理论上推测，肿瘤血管形成靶向基因治疗是一种有效的治疗方法。 采用这种治疗方法首先必需要考虑的一个问题是，如何将治疗药物输送并靶向定位到原发肿瘤和(或)肿瘤转移灶中。在肿瘤基因治疗中部分学者曾尝试采用病毒载体和非病毒载体来转移外源基因，局部注射于肿瘤中进行抗肿瘤治疗。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、痘病毒和疱疹病毒。非病毒载体包括裸DNA和脂质体介导的转染。然而动物模型显示这些方法的转染效率并不高，并且对于多发性的肿瘤转移灶以上基因转移方法并不适用。于是出现了一种新型的载体—细胞载体。在基因治疗的过程中，将获取的细胞在体外培养并进行基因转染，然后再将转染有外源基因的细胞回输体内。通过这种方法，携带外源基因的细胞就变成了一种载体。细胞载体可以解决病毒载体和非病毒载体无法解决的问题，使得外源基因得以在无法局部注射的部位或器官中表达。 内皮细胞参与肿瘤新生血管形成并且可以表达多种内源性和外源性基因，是很好的细胞载体。在体外对内皮细胞进行转染，然后将携带外源性基因的内皮细胞回输体内可以将转染的治疗药物局限于肿瘤组织。使用内皮细胞作为载体要求体外培养扩增并转染内皮细胞，但是内皮细胞在体外很难扩增并转染。研究发现，转染有SV40基因的内皮细胞增殖较快并且回输体内后可以特异性聚集在肿瘤的新生血管中。还有研究发现，血管内皮祖细胞也具有这种特性。但是，利用内皮细胞作为细胞载体还要面临一个问题，即外源性基因难以转入内皮细胞中。腺病毒可以用于转染处于任何细胞周期的多种细胞，并且容易操作，重组的腺病毒易于大量制备，可以用来体外转染内皮细胞。 本研究拟用重组腺病毒体外转染内皮细胞，为进一步动物体内肿瘤血管形成靶向基因治疗奠定基础。研究分五个实验进行。 实验一取Wistar大鼠的胸背主动脉，剪成小块后接种于铺有明胶的培养瓶中。倒置培养2小时后，翻转培养瓶继续培养。通过早期去除组织块、机械刮除杂细胞及胰酶消化法纯化内皮细胞。采用倒置显微镜观察内皮细胞形态及细胞生长过程，电镜下检测超微结构，免疫组化定性鉴定内皮细胞。结果显示，内皮细胞从组织块周围呈放射状向外生长，随后形成细胞克隆。接种于明胶上的大鼠主动脉内皮细胞早期相连形成毛细血管状，然后逐渐平铺于培养瓶底部。单层融合时，内皮细胞呈鹅卵石状和不规则形。培养中血管内皮细胞对基质有依赖性，表现出接触生长抑制和细胞生长的密度效应。电镜下观察发现，细胞内有Weibel一Palade小体，细胞间存在紧密连接。检测内皮细胞特异性标志物，CD3;表达阳性，而a一SMA表达阴性。经过三种纯化方式纯化后可以获得较纯的大鼠主动脉内皮细胞。细胞体外培养2月后，传代到9代开始衰老。 实验二用含有SV40肿瘤抗原的质粒转染实验一培养的内皮细胞，G418加压筛选。将获得的阳性细胞通过有限稀释法克隆后扩增培养。在光镜下观察转染前后细胞的形态、生长特性;流式细胞仪检测细胞增殖周期及核型;免疫组化和Matrigel研究细胞分化。结果显示，以18加压筛选10天后可以见到阳性细胞克隆。Sv4O肿瘤抗原转染后的大鼠内皮细胞保持二倍体核型，具有正常内皮细胞的部分生物学特性，如呈单层生长，具有生长接触抑制，能够表达内皮细胞特异性免疫组化标记物，在Matrigel上可以形成毛细血管样结构，细胞不能在软琼脂中克隆生长。与正常的大鼠内皮细胞相比，转染了SV40肿瘤抗原后的大鼠内皮细胞增殖速度增快、生命期延长、并且对血清和生长因子依赖性降低。本实验表明，经SV40转染的大鼠内皮细胞体外生命期延长，未发生恶性转 II化，仍保持正常内皮细胞部分生物学特性。本实验建立的SV40转染后内皮细胞可作为体外研究血管形成的稳定内皮细胞株。 实验三在实验二的基础上，提取转染前后细胞的基因组DNA，用PCR检测SV4OT抗原基因的整合;免疫组化蛋白水平检测