前言肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis induced ligand,TRAIL)可选择性地诱导癌细胞凋亡,而对正常细胞无显著毒性作用,从而成为肿瘤治疗的研究热点。然而,许多肿瘤细胞对TRAIL诱导的细胞凋亡缺乏敏感性,其调控机制仍不明确,这使TRAIL的临床应用受到很大的限制。研究表明,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性不仅仅是TRAIL受体的表达不同,更主要的是由于作用于TRAIL受体下游众多调控因子的作用。当然,肿瘤细胞对TRAIL的耐受性并不是一成不变的,化疗药物、RNA合成抑制剂或蛋白质合成抑制剂可调控TRAIL的敏感性。因此,探讨对TRAIL敏感性的调控因子及机制有助于肿瘤的治疗。基于TRAIL在肿瘤治疗中的重要作用及其面临的挑战,我们致力于寻求TRAIL的调控因子并探讨其机制。程序性细胞死亡因子4(Prgrammed cell death 4,PDCD4)作为新近发现的一种肿瘤抑制剂,可以抑制肿瘤的发生、进展及转移,并且可以提高肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。既然PDCD4在肿瘤的发生、治疗及预后中起着重要的作用,那么,PDCD4能否增强胃癌细胞对TRAIL的敏感性?其调控机制如何?我们将重点放在了FLICE抑制蛋白(FLICE-inhibitory protein,FLIP)上。FLIP是凋亡抑制蛋白,是调控TRAIL诱导的细胞凋亡的重要因子。FLIP蛋白与半光天冬酶-8(Cysteine proteases with aspartate , caspase-8)有高度的结构相似性,能与caspase-8相互竞争而使其不能结合到Fas相关死亡受体包含蛋白(Fas associated DD-containing protein,FADD),从而抑制细胞凋亡。另外,磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase / Ser/Thr protein kinase, PI3K/Akt)途径在调控细胞的增生、存活及迁移的过程中起着重要的作用。研究表明,PDCD4可被Akt磷酸化从而抑制其活性。我们设想PI3K/Akt是PDCD4的上游调控因子。我们以往的研究发现TRAIL可以诱导胃癌细胞或肝癌细胞的凋亡,并且发现了一些可调控TRAIL敏感性的因子如端粒酶逆转录酶、DNMT1基因及阿司匹林。PDCD4对TRAIL诱导胃癌细胞凋亡的敏感性的影响国内外尚未见文献报道,为此我们观察了PDCD4对TRAIL敏感性的影响,并对FLIP和PI3K/Akt途径在此过程中的作用进行了研究。材料和方法1.细胞株和抗体人胃癌细胞株MKN28、SGC7901、BGC823于含10%标准胎牛血清的RPMI1640培养基,37℃、5%CO2孵箱内培养。可溶性重组人TRAIL购自ProSpect(以色列);羊抗人PDCD4、鼠抗人FLIP、鼠抗人caspase-8及活化的caspase-8(cleaved-caspase-8) (p41/43)、鼠抗人Akt及磷酸化Akt(p-Akt)购自SantaCruz(美国);鼠抗人β-actin、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)包被的羊抗鼠二抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗购自Boister(中国)。2.含PDCD4基因质粒构建和转染pBluescriptR-PDCD4质粒(Invitrogen,美国)经限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后获得PDCD4 cDNA片段。将PDCD4片段亚克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP(全军烧伤研究所),转染至感受态大肠杆菌DH5α,接种至含30%卡那霉素的LB培养皿中,挑取单个菌落进行扩大培养,提取质粒并经酶切及测序鉴定获得含PDCD4基因的质粒,命名为pIRES2-PDCD4。利用脂质体2000(Invitrogen)转染至胃癌细胞BGC823中。转染细胞经G418筛选3 W,获得表达绿色荧光的单个细胞克隆,进行扩大培养,获得稳定过表达PDCD4的细胞系。3. PDCD4 RNA干扰针对PDCD4的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)片段(5’GTGCTTCTG AGTTACTCTA3’)亚克隆至pRNAT-U6.1/Neo载体,经测序鉴定后转染至胃癌细胞MKN28中,经G418筛选后获得干扰PDCD4表达的细胞系。4. Western Blot细胞经裂解液裂解30min,低温离心15min,取上清得细胞总蛋白。50μg蛋白加入2×上样缓冲液于100℃变性5min,经SDS-PAGE电泳分离,转移至硝酸纤维素膜上,结合特异性抗体及相应二抗,经增强化学发光剂(enhanced chemilum inescence,ECL)( Bioster,中国)显色,经X光片曝光、显影、定影,图片经BandScan软件进行灰度分析。5.逆转录多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)细胞总RNA经Trizol(Invitrogen)提取。RT-PCR反应参照RT-PCR试剂盒(Promega,美国)操作说明书进行。β- actin作为内参照,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪(Bio-Rad ,美国)分析。6.细胞存活率和凋亡率检测胃癌细胞接种至96孔板,经TRAIL作用后,以0.5mg/ml噻唑兰(Thiazolyl blue,MTT)作用4h,加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)振摇10min,经酶标仪(BioRad,美国)于490nm波长下检测吸光度。细胞存活率为处理组吸光度值除以未处理组吸光度值。细胞核经二脒基苯基吲哚(diamidino-phenyl-indole, DAPI)染色,激光共聚焦显微镜(LSM510,META,德国)观察细胞核形态改变并计数细胞凋亡率。7.统计学分析数据以x±SD表示,配对资料进行双尾t检验,P<0.05有统计学意义。结果1. PDCD4在胃癌细胞系中的表达与TRAIL的敏感性相关我们首先通过RT-PCR方法检测了不同分化程度的胃癌细胞中PDCD4 mRNA的表达结果发现PDCD4mRNA在MKN28细胞中的表达(0.25±0.03)明显高于BGC823细胞中表达(0.12±0.01),P<0.05。Western Blot检测发现PDCD4蛋白在MKN28细胞中表达(0.35±0.04)较BGC823细胞中表达(0.09±0.01)明显增高,P<0.05。MTT及细胞凋亡分析发现MKN28细胞对TRAIL最敏感,而BGC823细胞对TRAIL最不敏感。2.过表达PDCD4促进BGC823细胞对TRAIL的敏感性pIRES2-PDCD4转染至BGC823细胞中,经G418筛选后PDCD4蛋白和mRNA表达较未转染组明显增高,P<0.01。转染PDCD4后的BGC823细胞对TRAIL敏感性无论从时效性和量效性上均较未转染组明显增强。3.干扰PDCD4抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性PDCD4 shRNA转染至MKN28细胞后PDCD4表达较未干扰组明显降低,干扰效率为86%。干扰PDCD4的MKN28细胞对TRAIL敏感性较未干扰组明显降低。4.在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中,PDCD4调控FLIP表达为了验证PDCD4对FLIP的调控作用,我们用Western Blot检测了FLIP蛋白及caspase-8的活性,结果表明在过表PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白表达下降,而caspase-8活性增强。经TRAIL处理后,在过表达PDCD4的BGC823细胞中FLIP蛋白呈逐渐下降趋势,而caspase-8活性逐渐增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。干扰PDCD4后的MKN28细胞FLIP蛋白表达增强,caspase-8活性降低,并且经TRAIL处理后FLIP蛋白不再有下降趋势,caspase-8活性亦不呈现增高趋势,细胞对TRAIL的敏感性降低。为了探讨PDCD4调控FLIP的机制,我们用RT-PCR方法检测了PDCD4对FLIP mRNA表达的影响,结果发现过表达PDCD4后FLIP mRNA表达下降,而干扰PDCD4后FLIP mRNA表达增高。另外,经蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,PDCD4不再调控FLIP蛋白的表达。这表明PDCD4既调控FLIP的转录又通过调控蛋白酶体来调控FLIP蛋白的降解。5. PDCD4受PI3K/Akt途径调控首先,通过对不同胃癌细胞中Akt活性的检测,我们发现Akt活性MKN28细胞中表达最低,而在BGC823细胞中表达最高。通过LY294002抑制Akt活性后,BGC823细胞PDCD4表达增高,FLIP蛋白表达降低,caspase-8活性增强,并且细胞对TRAIL敏感性增强。结论1.PDCD4在胃癌细胞中的表达与TRAIL的敏感性相关,PDCD4表达越高,对TRAIL的敏感性越强。2.过表达PDCD4能增强BGC823细胞对TRAIL的敏感性。3.干扰PDCD4能抑制MKN28细胞对TRAIL的敏感性。4.PDCD4在TRAIL诱导的细胞凋亡过程中调控FLIP蛋白,并且这种调控作用既在转录水平,又在转录后水平。5.PDCD4本身受PI3K/Akt途径的调节。