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目的:研究正常生后早期大鼠脑室下区(SVZ)中NMDA受体亚单位NR1、NR2A、NR2B 的表达变化,受体所在的细胞类型,及NMDA受体对该区细胞增殖的影响。
方法:
1. 取正常生后早期大鼠(postnatal day 1, P1d、P3d、P7d、P14d、P21d、P28d),行免疫组织化学染色观察SVZ 中NMDA 受体亚单位NR1、NR2A 、NR2B的表达变化,同时观察该区内星形胶质细胞(GFAP+)、成熟神经元(NeuN+)、处于增殖期的细胞(PCNA+)细胞的变化情况。
2. 应用免疫荧光双标方法,观察SVZ 中NMDA 受体亚单位NR1 和神经干细胞标记物Nestin、星形胶质细胞标记物GFAP 以及处于增殖期细胞的标记物PCNA 的区域共存及细胞共存情况。
3. 取新生第三日大鼠,分别腹腔注射NMDA 受体激动剂NMDA(2mg/kg/d);
选择性非竞争性NMDA 受体拮抗剂MK-801(10mg/kg)以及NR2B 拮抗剂Ro25-6981(40mg/kg)在P7d、P14d、P28d 行免疫组织化学染色和HE 染色,观察三个时间点SVZ 中细胞增殖的变化。
4. 数据处理和结果统计:本研究细胞计数均采用高倍镜下测量SVZ 中单位面积(0.01mm2)阳性细胞密度表示结果,并计算相应阳性细胞密度占该时间点HE 染色下SVZ 总细胞密度的比例,以此来消除年龄变化对实验结果比较的干扰。
结果:
1. HE 染色结果显示,大鼠生后早期SVZ 中总的细胞数量和密度随年龄的增加呈下降趋势。各时间点的细胞密度分别约为:P1d:227/ 0.01mm2,P3d:265/0.01mm2,P7d:167 / 0.01mm2,P14d:120 / 0.01mm2,P21d:72 / 0.01mm2,P28d:64 / 0.01mm2。
2. 免疫组织化学的结果显示在生后早期大鼠各时间点SVZ 中的细胞上均表达有NR1、NR2A、NR2B;不同的亚单位表达呈现不同的变化趋势。其中NR1 在P1d 时其阳性细胞密度为45.50 ± 4.20 / 0.01mm2,细胞阳性率为17%,到P14d时,其阳性细胞密度出现一过性增加,达116.67 ± 14.57 / 0.01mm2,此时的阳性细胞率也达到高峰,为97%,之后开始下降,至P28d 时,与P1d相比,其阳性细胞密度的差异已没有统计学意义,但此时,其阳性细胞率却远高于P1d,可达75%;NR2A 和NR2B 在P1d 时其细胞阳性细胞密度相近,和阳性细胞率表达均很相近,分别为104.25 ± 7.14 / 0.01mm2,(37%)和93.00 ± 17.32 / 0.01mm2(35%),以后二者的阳性细胞密度和阳性细胞率均呈不同变化趋势,NR2A 阳性细胞密度随年龄的增长逐渐下降,到P28d 时降至36.00 ± 1.64 / 0.01mm2,其阳性细胞率在P14d 达到峰值(61%),之后,开始缓慢下降,P28d 时,仍远高于P1d(56%)。NR2B 的阳性细胞密度在7 天时达到高峰,为121.00 ± 15.56 / 0.01mm2,之后开始下降,到P28d时为63.33 ± 6.03/ 0.01mm2,和P1d 相比,有明显降低,其阳性细胞密度却呈持续缓慢增高的趋势,到P28d 时可高达90%以上。
3. SVZ 中的增殖细胞(PCNA+)在P1d 时,其阳性细胞密度可达99.60 ± 9.15 /0.01mm2,随着年龄的增加,阳性细胞密度明显降低,到P28d 时为29.20 ± 5.02/ 0.01mm2。阳性细胞率变化保持在37%到51%之间。
4. 星形胶质细胞标记物GFAP 在出生24 小时内的大鼠SVZ 区表达量非常低,P1d 时SVZ 区几乎看不到阳性反应,以后逐渐增高,P28d 时几乎占据整个SVZ 区。大鼠生后早期SVZ 区中几乎无NeuN+的细胞。
5. 免疫荧光双标结果显示,在SVZ 中观察到NR1 和Nestin 免疫荧光双标细胞和NR1 和PCNA 免疫荧光双标细胞的细胞;P1d 到P7d 时,NR1 和GFAP 的区域共存程度非常低;到了P14d 以后,二者在该区区域共存程度增加。
6. 给予NMDA 受体激动剂NMDA(2mg/kg/d),在P7d 时,SVZ 细胞密度明显增加;P14d 时PCNA+细胞密度明显增加。分别给予MK-801(10mg/kg)和Ro25-6981(40mg/kg),P7d 时PCNA 阳性细胞密度均显著降低,从P14d 以后逐渐升高。到P28d 时明显高于正常,其中Ro25-6981 组升高的更明显。
结论:大鼠生后早期SVZ 中的细胞表达有NMDA 受体亚单位NR1、NR2A、NR2B,随着年龄的增长,不同的亚单位表达呈现不同的变化趋势,其中部分细胞具有增殖特性。激活NMDA 受体后对SVZ 中细胞的增殖有正性调节作用,提示SVZ 区内的NMDA 受体具有功能活性,可以参与调节生后早期SVZ 区的神经发生。