毒品问题严重影响了社会的稳定和经济的发展。在我国,吗啡型毒品的危害程度、蔓延速度和影响范围非常之大。吗啡(morphine)是阿片(opium)的主要成分,是一种强效镇痛药。人们发现反复给予治疗剂量的吗啡后,其效力随之减弱,逐渐形成耐受(tolerance),此时必须增加剂量才可以继续起效。滥用药物者为了体验和追求吗啡所带来的欣快作用和避免停药后所带来的不适感,逐渐产生了成瘾(addiction)或称之为依赖(dependence)。目前大多数学者认为,包括阿片在内的精神活性物质依赖的本质是机体长期接触精神活性物质后,中枢神经系统在分子、细胞及神经网络水平发生的代偿性适应。目前关于吗啡成瘾的机制尚未完全阐明,几乎所有的中枢神经递质系统都有不同程度的参与。且这个过程不仅仅局限于神经元,胶质细胞也参与其中。谷氨酸是中枢神经系统内主要的兴奋性递质,参与了吗啡依赖的形成,并可能是吗啡依赖过程中重要的机制分子之一。细胞外谷氨酸的浓度主要靠谷氨酸转运体的调节,谷氨酸转运体-1(Glutamate Transporter-1,GLT-1)是这些谷氨酸转运体中分布最广、最主要的功能执行者。文献报道GLT-1参与了吗啡依赖的形成。但GLT-1如何影响吗啡依赖的形成过程及具体机制尚未完全阐明。水通道4(Aquaporin 4,AQP4)是中枢神经系统中含量最丰富的水通道亚型,在中枢神经系统水代谢和渗透压调节中占据主导地位。我室前期实验证明AQP4与吗啡成瘾密切相关,在吗啡依赖形成过程中,AQP4与GLT-1的表达均下调。AQP4基因敲除能够抑制吗啡慢性处理所致的GLT-1表达下调、谷氨酸重摄取能力的降低及突触间隙谷氨酸水平的改变,并且给予GLT-1特异性抑制剂二氢卡因酸盐(Dihydrokainate,DHK)能够增加AQP4基因敲除小鼠吗啡躯体依赖的形成。但AQP4与GLT-1之间是否有直接关系仍然不清楚。根据文献报道,AQP4与GLT-1均特异性的分布于星形胶质细胞中,且都参与了吗啡依赖的形成过程,提示AQP4可能通过调节星形胶质细胞GLT-1的表达及功能,影响突触间隙谷氨酸的水平来影响吗啡依赖的形成。考虑到AQP4与GLT-1在功能上尚未发现有交互关系,因此我们推测AQP4通过与GLT-1能形成大分子复合体,借助蛋白质相互作用机制,调节星形胶质细胞GLT-1的表达及功能。有文献报道阿片依赖时脑内蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性增加,并且可能与阿片依赖与耐受的形成有关。AQP4的表达受到PKC的调控,PKC的活化能够抑制AQP4的表达。因此我们推测吗啡依赖形成过程中,吗啡通过阿片受体激活后续信号通路调控PKC活性,活化的PKC进而调控AQP4的表达及AQP4相关复合物的功能,从而影响阿片依赖的形成。本课题希望通过这些研究深入了解AQP4在吗啡依赖过程中的作用,为加深对AQP4功能的了解及吗啡依赖的生物学研究开拓新领域。实验方法:1)大鼠采用递增给药的方式,从第1天至第5天皮下注射吗啡,剂量分别10、20、30、40、50 mg/kg,每天两次(8:00和17:00),建立慢性吗啡躯体依赖模型。用戒断症状评分以判断模型建立是否成功。通过实时定量PCR(Real-time PCR)和Western blot方法,从mRNA水平和蛋白水平检测AQP4、GLT-1、μ阿片受体(Mu Opiate Receptor,MOR)在大鼠前额叶皮层、海马、伏隔核及纹状体的表达变化。2)采用二丁酰环腺苷酸(N6,2’-O-Dibutyryladenosine 3’5’-cyclic monophosphate sodium salt,d Bc AMP)诱导法培养星形胶质细胞。培养成熟的星形胶质细胞加入1μM的吗啡作用72 h建立吗啡依赖模型。用能否发生纳洛酮超射现象判断模型是否成功。从m RNA水平和蛋白水平检测星形胶质细胞内AQP4、GLT-1、MOR的表达变化。3)首先通过免疫荧光化学的方法,分别对大鼠大脑皮层冰冻切片和星形胶质细胞进行免疫组化染色,观察AQP4、GLT-1和MOR的共定位情况。提取大鼠大脑皮层和体外培养的星形胶质细胞的蛋白,通过免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的方法和荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)方法验证大分子复合物的存在。4)建立外源表达的AQP4-p EGFP-N1、GLT-1-p Ds Red的载体,共转染于HEK293细胞,以进一步验证复合物的存在。通过分子生物学方法对AQP4进行突变,将C末端缺失,寻找与AQP4和GLT-1相互作用相关的区域。5)在星形胶质细胞上给予PKC的激动剂丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和拮抗剂白屈菜赤碱(chelerythrine),观察PKC信号通路如何影响AQP4、GLT-1、MOR的表达,与吗啡依赖过程中这三个分子表达的变化有何关系,进一步阐明机制。实验结果:1)成功建立了大鼠躯体依赖模型。造模成功的大鼠表现出湿狗样摇体、齿抓、咀嚼、纵涎、流泪、毛发直立、眼睑下垂、腹泻等戒断症状,纳洛酮伴随给药组未出现明显戒断症状。吗啡依赖后,大鼠的前额叶皮层、海马、伏隔核和纹状体四个脑区的AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白均表现出下调的趋势,纳洛酮伴随给药组AQP4、GLT-1、MOR的下调被抑制。2)优化了原代星形胶质细胞的培养方法,并且建立了星形胶质细胞的吗啡依赖模型。吗啡依赖的星形胶质细胞在加入纳洛酮后出现超射。吗啡依赖后,星形胶质细胞内AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白均表现出下调的趋势,纳洛酮伴随给药组AQP4、GLT-1、MOR的下调被抑制。3)通过免疫组化的方法证明,在大鼠大脑皮层和星形胶质细胞中,AQP4、GLT-1、MOR显示在细胞膜上共定位。进一步采用免疫共沉淀和荧光能力共振转移的方法证明,在大鼠大脑皮层组织和体外培养的星形胶质细胞中,AQP4和GLT-1可相互被沉淀下来且可以发生FRET现象。AQP4和MOR也相互被沉淀下来且可以发生FRET现象。但是GLT-1和MOR不能相互被沉淀下来且没有发生FRET现象。4)构建AQP4、GLT-1和AQP4的C末端缺失表达载体,几种载体在HEK293细胞中的表达效率较高。将AQP4-p EGFP-N1和GLT-1-p Ds Red共转于293细胞中,发现外源表达的野生型AQP4和GLT-1可以相互被沉淀下来。将AQP4-CTD-p EGFP-N1和GLT-1-p Ds Red共转于293细胞中,发现C末端缺失的AQP4和GLT-1不能相互被沉淀下来。5)给予PKC的激动剂PMA可减少星形胶质细胞AQP4、GLT-1、MOR的表达,给予PKC的拮抗剂后再进行吗啡慢性给药,吗啡慢性处理导致的AQP4、GLT-1、MOR的下调被抑制。结论:1)在大鼠的躯体吗啡依赖模型和体外培养的星形胶质细胞吗啡依赖模型中,均发现AQP4、GLT-1、MOR的m RNA和蛋白质的表达下调。提前给予纳洛酮拮抗MOR,可抑制它们的下调,说明在吗啡依赖过程中这三个分子的变化是与μ阿片受体直接相关的。2)AQP4和GLT-1在生理状态下以复合物的形式存在,同时AQP4在体内还与MOR形成复合物参与吗啡依赖的调节。GLT-1和MOR虽然分布具有重叠,但并不能形成复合物。3)外源表达的AQP4和GLT-1也可以形成复合物,AQP4的C末端与AQP4和GLT-1的相互作用有关。4)阻断PKC信号通路可以抑制吗啡慢性处理所导致的AQP4、GLT-1、MOR下调。本研究首次证实了AQP4/GLT-1、AQP4/MOR复合物的存在。吗啡通过激活μ受体及受体后PKC信号通路,下调AQP4的表达。AQP4通过蛋白质相互作用机制,调节星形胶质细胞GLT-1的表达及功能,进而影响突触间隙谷氨酸的水平来参与吗啡依赖的形成。以上结果为阐明AQP4参与吗啡依赖的分子机制提供了重要的实验依据。