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本研究采用差速离心和密度梯度离心技术纯化禽传染性支气管炎病毒(IBV),用纯化的IBV作包被抗原,建立了检测IBV DNA疫苗免疫后鸡血清中特异性抗体的间接ELISA方法。确定了抗原最佳包被浓度为5μg/ml,待检血清稀释度为1:320,酶标抗体的最佳稀释度为1:10000,血清样品阴、阳性判断临界值S/N为1.27。 应用间接ELISA方法检测IBV DNA疫苗免疫抗体,结果表明:IBV的S1、M、N基因DNA疫苗单独免疫或混合免疫均能刺激机体产生特异性抗体;且DNA疫苗各组抗体水平极显著(P<0.01)高于空白对照组和空质粒对照组。强毒攻毒实验结果表明:IBV的各DNA疫苗对强毒攻击都有保护率,保护率分别是S1基因40%(8/20)、M基因70%(14/20)、N基因70%(10/14),三基因混合DNA疫苗90%(18/20)。结合抗体检测结果分析得出:三基因混合DNA疫苗免疫效果优于单基因DNA疫苗免疫效果;单基因DNA疫苗中,M基因疫苗和N基因疫苗优于S1基因疫苗。 根据本课题组在GeneBank中注册的中国禽传染性支气管炎分离株的8条M基因序列(AY302742～AY302749),设计了一对引物,采用RT-PCR方法,获得了IBV分离株膜蛋白基因(M)的融合表达片段,并将其克隆到pMD18-T载体测序。将此片段插入大肠杆菌原核表达载体pET30b(+)中,构建了表达IBV M基因的重组真核表达质粒pET30-M,转化入大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析表明:M基因在大肠杆菌中获得了表达,表达蛋白分子量约为26KD。在TB培养基、Kna浓度为100μg/ml、温度为30℃、IPTG浓度为0.4mmol/L的诱导表达条件下,蛋白表达量达到菌体总蛋白的10%。表达的IBVM蛋白可作为制备IB诊断抗原,基因工程疫苗的基础材料。以上研究对IB的诊断、防治有重要理论价值和实用价值。