论文部分内容阅读
手性醇是合成多种手性药物的重要中间体，羰基还原酶可以高效地催化潜手性酮的还原，是制备手性醇的重要方法之一。来源于金黄杆菌CA49(Chryseobac terium sp.CA49)的羰基还原酶ChKRED20对多种苯乙酮类衍生物及脂肪族酮酯类具有很高的催化活性及优异的立体选择性，该酶能够高效不对称生物合成上市药物替格瑞洛、立普妥及阿瑞匹坦等的手性醇中间体。本研究采用蛋白质工程技术，结合定向进化和基于晶体结构的半理性设计方法，对该酶的性能进行了多方位的提升:(1)大幅增强了ChKRED20的热稳定性;(2)提高了该酶对药物中间体2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮的活性;(3)拓展了对大位阻底物的催化能力;(4)反转了对邻位苯乙酮衍生物的立体选择性。结合羰基还原酶ChKRED20全酶及ChKRED20/NAD+复合物的晶体结构，对酶活性、底物特异性和立体选择性与酶细微结构之间的关系进行了深入地分析。论文主要包括以下几部分工作: 第一部分，通过定向进化提高羰基还原酶ChKRED20的热稳定性。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是具有重要工业意义的手性醇中间体，用于合成HMG-CoA的还原酶抑制剂，例如重磅炸弹药物立普妥。重组的野生型羰基还原酶ChKRED20可催化前体4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的不对称还原生成高光学纯度的(S)-CHBE。为了进一步提高催化效率，我们试图利用耐热性较好的突变子在较高的反应温度下实施生物催化反应温度，使合成(S)-CHBE的时空转化率得以提高。通过对ChKRED20基因进行随机突变并对文库进行高通量筛选，并进一步整合3个有益的突变位点，获得了热稳定性大幅度提高的突变体MC135，其最适反应温度升高至65℃，连续处理15天后残余活性大于95％，相比之下，野生型ChKRED20在65℃条件下所测定的热失活半衰期(t1/2)仅有11.9min。突变体MC135粗酶液（3g/l）在65℃条件下可在1小时内完全转化300g/L的底物，ee值＞99.5％，时空产率为1824mM/h，而野生型ChKRED20在该温度下30min内便完全失去活力;野生型粗酶液(3g/l)在50℃条件下完全转化300g/L底物则需要3小时，时空产率为608mM/h。 第二部分:通过定向进化增强该酶对药物中间体2-氯-1-(3，4-二氟苯基)乙酮(CFPO)的活性。在替格瑞洛手性醇中间体(S)-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇((S)-CFPL)的生物合成中，我们筛选了同样的随机突变文库，获得了比活力较高的突变子H145L、L205M，并进一步构建和筛选了这两个位点的饱和突变文库，获得了酶活力大幅提高的突变子L205A。突变子L205A的比活力为178U/mg，是野生型比活力的10倍，并且该突变体的催化效率(kcat/Km)是野生型的15倍，在50℃的热失活半衰期(t1/2)增加了70％。在40℃条件下，突变体L205A粗酶液(3g/L)可在20小时内完全转化200g/L的底物，生物合成光学纯(S)-CFPL，ee值＞99.5％，而野生型ChKRED20不能耐受200g/L的底物浓度，完全转化100和150g/L底物分别需要16小时和26小时。该工作对生物合成法生产替格瑞洛手性醇中间体的实际应用具有重要推动作用。 第三部分，羰基还原酶全酶及ChKRED20/NAD+复合物晶体结构的解析。我们分别通过镍柱/GST亲和层析柱、阴离子交换色谱、Superdex75凝胶排阻色谱三步蛋白纯化获得了ChKRED20结晶级纯酶，然后采用悬滴法对ChKRED20的结晶条件进行筛选，最终利用X-ray晶体衍射技术得到了分辨率为1.8(A)的ChKRED20晶体结构及1.6(A)的ChKRED20/NAD+复合物晶体结构。ChKRED20晶体结构的亚单元拓扑结构与其他同源结构类似，为Rossman-fold结构，主要由6个α/β二级结构单元构成，平行β片层位于内部，α螺旋位于外部。其中β片层较短，外侧的α螺旋较长，从而形成一个大的凹陷的口袋。ChKRED20/NAD+复合物晶体结构中，NAD+作为辅酶，平躺在底物口袋中，深入口袋底部，口袋入口处的柔性区域与ChKRED20晶体结构略有不同。 第四部分，通过半理性设计拓展ChKRED20酶的底物谱。基于对羰基还原酶ChKRED20晶体结构的分析，我们尝试对分子对接模拟结构中的底物邻位取代基附近9个氨基酸残基进行首轮丙氨酸扫描，然后对有益位点进行整合后发现突变体H145A/M201A在转化1-(2-氟苯基)乙酮具有更好的催化特性。我们进一步以H145A/M201A为模板，选择羰基还原酶ChKRED20的晶体结构中距离145His和205Met在7(A)之内的9个氨基酸残基建立单点饱和突变文库，以1-(2-氯苯基)乙酮为底物，应用高通量筛选方法筛选的到底物特异性改变较大的H145A/M201A/S153R和H145A/M201A/Y188L，其中，H145A/M201A/Y188L的立体选择性也发生了反转。然后，通过将底物口袋外部边缘的氨基酸残基进行饱和突变，并以1-(2，4-二甲基苯基)乙酮为底物进行高通量筛选，最终获得了底物特异性进一步改变的突变子H145A/M201A/S153R/Q97A/N39D，该突变子的底物谱比野生型ChKRED20更加广泛。 综上，本研究将定向进化及半理性设计应用于羰基还原酶ChKRED20的分子改造，获得了若干功能改进的突变体，促进了该酶在多种手性药物中间体合成中的工业应用。并且，羰基还原酶ChKRED20/NAD+复合物晶体结构的解析不仅有助于我们了解其结构与功能的关系，而且为我们理解突变体酶功能改进的分子机制提供了一些线索。