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金银花有较高的药用价值，应用广泛。但是，其原料植物来源复杂，品种混淆严重，采收时期混乱，标准缺乏，导致药材质量参差不齐。严重制约了金银花在临床和生产上的高效利用。为解决这些问题，本课题以不同生长阶段金银花（幼蕾期S1，青蕾期S2，二白期S3，白蕾期S4，银花期S5，金花期S6）为研究材料，运用植物化学、生理学和分子生物学手段研究金银花花器官发育过程中绿原酸和木犀草苷积累动态规律和调控机制。同时，系统开展了不同来源金银花药材质量评价研究。主要研究结果如下：
1.绿原酸和木犀草苷的积累动态与其生物合成调控关键基因的表达特征相关
我们发现在不同生长阶段金银花中绿原酸和木犀草苷的含量积累动态均呈先增加后降低趋势。相对于其他生长时期，绿原酸含量在S3阶段最高，木犀草苷在S3和S4阶段均有较高的含量。同时，在金银花不同生长阶段，HQT，CHI活力的变化与绿原酸和木犀草苷的合成和积累明显正相关。另外，金银花发育过程的花蕾阶段（S1-S4），苯丙氨酸代谢起始调控酶（PAL，C4H，4CL）的活力也与绿原酸和木犀草苷含量的积累又明显关联。进一步研究发现，不同生长阶段金银花中 HQT的转录水平与HQT活性变化和绿原酸含量积累密切相关。基于上述结果，在生产上应将S3和S4期作为高品质金银花的采收期。
2.金银花花冠筒中绿原酸主要在叶绿体和细胞质中合成，最终储存在液泡中
原位杂交技术、多克隆 HQT抗体结合免疫细胞化学技术测定的结果显示：HQT的组织和细胞特异性表达显著影响了绿原酸的在组织和细胞中的分布。例如，S1-S3阶段，HQT在花冠筒内外表皮细胞，薄壁组织细胞及维管束细胞均有大量表达，绿原酸也在这些组织有大量分布。随着花器官发育成熟和衰老，S5-S6阶段，HQT和绿原酸只在其维管束附近和内表皮细胞有少量表达和积累。HQT抗体胶体金和漆酶胶体金结果显示，在花器官发育早期（S1-S2），两种标记的金颗粒主要在叶绿体和细胞质中。进入中期（S3-S4），随着叶绿体结构和功能的衰退，叶绿体上的淀粉粒逐渐降解和破毁。此过程中，叶绿体上 HQT抗体标记的胶体金颗粒逐渐减少，主要分布在细胞质中。细胞质随着液泡的膨大逐渐变的淡薄，在细胞质或者质体中标记的漆酶金颗粒逐渐减少，而其在液泡中逐渐增多。花蕾完全开放后（S5，S6），中央大液泡几乎占住整个细胞，少数的HQT抗体金颗粒分布在稀薄的细胞质中，而漆酶标记金颗粒主要集中分布在液泡中。金银花花器官发育的不同阶段在液泡和细胞壁中均未发现有 HQT抗体金颗粒。这说明绿原酸在金银花花器官发育早期阶段主要在叶绿体和细胞质中合成和储存，到了花器官发育后期，少量绿原酸可在细胞质中合成，主要储存于液泡中。
3.二倍体和四倍体金银花及不同来源金银花药材质量评价
3.1二倍体和四倍体金银花药材质量比较
虽然部分多酚类物质在两种倍性金银花不同生长阶段中的积累规律存在明显差异，但是，多数成分在四倍体中的积累量均明显高于二倍体。抗氧化能力结合主成分和相似性分析方法研究表明，四倍体金银花多数生长阶段的抗氧化能力较二倍体明显提高，并且两种倍性金银花的抗氧化能力与绿原酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷等成分变化呈现明显正相关（P<0.05），特别是与绿原酸和木犀草苷的含量变化最密切。四倍体金银花中绿原酸、木犀草苷、金丝桃苷和总黄酮等成分产量均在S3-S5阶段具有较高的产量，并且在S3-S5阶段同样具有较高的抗氧化能力。因此，S3-S5阶段均可作为四倍体金银花的最佳采收期。
3.2.药用植物金银花与其近缘种化学指纹图谱比较研究
ATR-FTIR技术结合PCA和HCA方法测定和分析结果显示，ATR-FTIR结合PCA和 HCA分析技术可以快速鉴定出金银花与其近缘种化学成分差异，两种方法一致显示，忍冬与华南忍冬化学成分种类较相似，与灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬化学成分存在明显差异。载荷因子分析显示，金银花和其近缘种化学指纹图谱差异主要与不同样品中有机酸和黄酮类成分组成和含量的变化密切相关。利用混标法同时测定不同样品10种化学成分含量差异，绿原酸以样品D中最高，异绿原酸A和C含量以样品C最高；木樨草苷含量以样品A最高，样品B最低。SIMCA数学模型可以成功预测金银花和其近缘种（山银花），且判断准确率能够达100%。研究结果对快速鉴定和控制金银花药材来源混乱问题及提高临床疗效均有较大实际指导意义。
1.绿原酸和木犀草苷的积累动态与其生物合成调控关键基因的表达特征相关
我们发现在不同生长阶段金银花中绿原酸和木犀草苷的含量积累动态均呈先增加后降低趋势。相对于其他生长时期，绿原酸含量在S3阶段最高，木犀草苷在S3和S4阶段均有较高的含量。同时，在金银花不同生长阶段，HQT，CHI活力的变化与绿原酸和木犀草苷的合成和积累明显正相关。另外，金银花发育过程的花蕾阶段（S1-S4），苯丙氨酸代谢起始调控酶（PAL，C4H，4CL）的活力也与绿原酸和木犀草苷含量的积累又明显关联。进一步研究发现，不同生长阶段金银花中 HQT的转录水平与HQT活性变化和绿原酸含量积累密切相关。基于上述结果，在生产上应将S3和S4期作为高品质金银花的采收期。
2.金银花花冠筒中绿原酸主要在叶绿体和细胞质中合成，最终储存在液泡中
原位杂交技术、多克隆 HQT抗体结合免疫细胞化学技术测定的结果显示：HQT的组织和细胞特异性表达显著影响了绿原酸的在组织和细胞中的分布。例如，S1-S3阶段，HQT在花冠筒内外表皮细胞，薄壁组织细胞及维管束细胞均有大量表达，绿原酸也在这些组织有大量分布。随着花器官发育成熟和衰老，S5-S6阶段，HQT和绿原酸只在其维管束附近和内表皮细胞有少量表达和积累。HQT抗体胶体金和漆酶胶体金结果显示，在花器官发育早期（S1-S2），两种标记的金颗粒主要在叶绿体和细胞质中。进入中期（S3-S4），随着叶绿体结构和功能的衰退，叶绿体上的淀粉粒逐渐降解和破毁。此过程中，叶绿体上 HQT抗体标记的胶体金颗粒逐渐减少，主要分布在细胞质中。细胞质随着液泡的膨大逐渐变的淡薄，在细胞质或者质体中标记的漆酶金颗粒逐渐减少，而其在液泡中逐渐增多。花蕾完全开放后（S5，S6），中央大液泡几乎占住整个细胞，少数的HQT抗体金颗粒分布在稀薄的细胞质中，而漆酶标记金颗粒主要集中分布在液泡中。金银花花器官发育的不同阶段在液泡和细胞壁中均未发现有 HQT抗体金颗粒。这说明绿原酸在金银花花器官发育早期阶段主要在叶绿体和细胞质中合成和储存，到了花器官发育后期，少量绿原酸可在细胞质中合成，主要储存于液泡中。
3.二倍体和四倍体金银花及不同来源金银花药材质量评价
3.1二倍体和四倍体金银花药材质量比较
虽然部分多酚类物质在两种倍性金银花不同生长阶段中的积累规律存在明显差异，但是，多数成分在四倍体中的积累量均明显高于二倍体。抗氧化能力结合主成分和相似性分析方法研究表明，四倍体金银花多数生长阶段的抗氧化能力较二倍体明显提高，并且两种倍性金银花的抗氧化能力与绿原酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷等成分变化呈现明显正相关（P<0.05），特别是与绿原酸和木犀草苷的含量变化最密切。四倍体金银花中绿原酸、木犀草苷、金丝桃苷和总黄酮等成分产量均在S3-S5阶段具有较高的产量，并且在S3-S5阶段同样具有较高的抗氧化能力。因此，S3-S5阶段均可作为四倍体金银花的最佳采收期。
3.2.药用植物金银花与其近缘种化学指纹图谱比较研究
ATR-FTIR技术结合PCA和HCA方法测定和分析结果显示，ATR-FTIR结合PCA和 HCA分析技术可以快速鉴定出金银花与其近缘种化学成分差异，两种方法一致显示，忍冬与华南忍冬化学成分种类较相似，与灰毡毛忍冬和黄褐毛忍冬化学成分存在明显差异。载荷因子分析显示，金银花和其近缘种化学指纹图谱差异主要与不同样品中有机酸和黄酮类成分组成和含量的变化密切相关。利用混标法同时测定不同样品10种化学成分含量差异，绿原酸以样品D中最高，异绿原酸A和C含量以样品C最高；木樨草苷含量以样品A最高，样品B最低。SIMCA数学模型可以成功预测金银花和其近缘种（山银花），且判断准确率能够达100%。研究结果对快速鉴定和控制金银花药材来源混乱问题及提高临床疗效均有较大实际指导意义。