研究背景及目的20世纪30年代,现代神经外科之父,美国神经外科专家Harvey Williams Cushing (1869.04.08-1939.10.07)教授曾言：“颅咽管瘤是最使神经外科医生沮丧的疾病。”中国著名神经外科专家漆松涛教授曾说：“颅咽管瘤是神经外科医生最具挑战性的疾病,其手术治疗与术后管理最体现神经外科医生水平。”虽然100多年来,颅咽管瘤的起源认识与手术治疗取得了阶段性进展,但是缺乏稳定的肿瘤细胞系,即缺乏相应的研究平台,颅咽管瘤的基础研究尚显薄弱。19世纪末,一些病理学家注意到一类罕见的生长于蝶鞍区的上皮肿瘤。在1904年奥地利Erdheim教授首次细描述了该肿瘤的组织学特征,提出该肿瘤的发生与胚胎的咽鼓管相关,并将其作为鞍区肿瘤的单独一类疾病进行描述。随后在1932年,美国神经外科专家Harvey Williams Cushing教授在书中第一次将其命名为“颅咽管瘤”,并对其进行了详细的描述,从而统一规范命名,一直沿用至今。颅咽管瘤是儿童鞍区最常见的肿瘤,由外胚叶形成颅咽管的残余上皮细胞发展起来的一种常见的胚胎残余组织肿瘤,亦为颅内最常见的先天性肿瘤。肿瘤的发生目前主要有两种争论学说。第一种为先天胚胎残余上皮细胞学说：胚胎发育第二周,原始口腔顶部开始向上突起,逐渐发展为伸长的盲囊,即拉克氏囊(Rathkes Pouch),位于脊索的前端。稍晚一些在前颅窝底部向下出现漏斗突,两者逐渐靠近,最后发展为垂体。Rathke氏袋与原始口腔相连部分逐渐变细形成一道官腔,称之为颅咽管。Rathke氏袋在第8周后由简单的表皮结构迅速增殖形成腺垂体(垂体前叶、结节部),漏斗则形成神经垂体(垂体后叶)。正常垂体结节部、漏斗附近有残存上皮细胞,大多数学者认为颅咽管瘤起源于这些残存的细胞。第二种为上皮细胞化生学说：不少学者认为垂体结节部的上皮细胞是垂体细胞化生的产物,而非胚胎残留细胞。目前肿瘤起源的解释仍存在诸多补充分的证据,具有很大的争议。2007年WHO中枢神经系统肿瘤病理分型将其分为釉质型颅咽管瘤(adamantinomatous craniopharyngioma ACP)和鳞状乳头型颅咽管瘤(papillary craniopharyngioma PCP)两型,前者约占90%。尽管WHO病理分级两者都属于I级,但临床上呈现出“良性病理,恶性生物行为”的表现,尤其发生在釉质型颅咽管瘤的严重下丘脑炎症粘连和脑组织侵犯。釉质型颅咽管瘤石蜡切片染色可见肿瘤实质外周为单层柱状上皮细胞呈“栅栏样”排列,其内侧可见大片“疏松星形网状”细胞,肿瘤中心可见炎细胞浸润、“涡轮状”细胞、牙本质小体、湿性角化物、钙化、坏死凋亡细胞、胆固醇结晶等结构。在肿瘤与下丘脑交界处,肿瘤外侧脑组织呈胶质细胞增生以及肿瘤呈“指状”侵犯脑组织。鳞状乳头型颅咽管瘤病理HE染色肿瘤呈有规律的鳞状上皮细胞排列呈乳头状,炎症细胞浸润主要发生在肿瘤间质,较釉质型轻,肿瘤与周边脑组织边界清楚。手术治疗是治疗颅咽管瘤的首选方法,也是唯一治愈该疾病的方法。随着影像学及显微外科器械的发展与应用,颅咽管瘤起源分型的认识及手术入路理念的革新,积极的外科手术首次全切除肿瘤逐渐为绝大多数神经外科医生所认可。但是,颅咽管瘤位置的深在和毗邻结构的重要性,以及肿瘤外周的炎症黏连牵拉、脑组织侵犯及钙化等,使得手术的全切除率、肿瘤的复发率及术后生存质量依然颅咽管瘤临床治疗过程中面临的难题。稳定肿瘤细胞系的缺乏,阻碍着颅咽管瘤的基础研究发展,使得目前大部分停留在组织学层面去探索肿瘤的发生发展、炎症、内分泌、钙化、复发等。目前认为釉质型颅咽管瘤主要发病机制是在胚胎发育早期,Rathkes囊残存细胞编码β-catenin的CTNNB1 exon3发生突变,使得β-catenin不能与降解复合物结合从而导致其在胞浆中积累并入核,从而导致肿瘤的发生。2014年德国神经病理学家Holsken教授首次在组织病理切片上证实釉质型颅咽管瘤“涡轮状”细胞共表达β-catenin入核与肿瘤干细胞标志物CD 133, CD44,并将这一类细胞亚群命名为颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞(craniopharyngioma stem-like cells, CSLCs) 。 Holsken教授在其文中证实CSLCs仅存在于釉质型颅咽管瘤中,这与肿瘤的发生发展、肿瘤的复发密切相关。人源性颅咽管瘤细胞系是研究颅咽管瘤生物学特点、肿瘤的发生发展、病因病理机制、临床治疗探索与评估等极其重要手段之一。颅咽管瘤属于上皮细胞来源的良性肿瘤,体外培养建立稳定的细胞系尤为艰辛,间接导致了颅咽管瘤细胞学层面的深入研究甚少,对深入开展基础与临床相结合的转化医学研究存在严重的困扰。早在1997年,德国Honegger教授首次报道成功培养出釉质型颅咽管瘤细胞,在短期的细胞培养证明了孕激素可以与肿瘤细胞表面的孕激素受体结合,并促进肿瘤增值；随后在2005年,德国Ulfarsson教授采用胰酶消化法培养出釉质型颅咽管瘤细胞,并证实胰岛素生长因子I(insulin-like growth factor 1 IGF-1)可以促进其肿瘤细胞的增值；2010年德国Holsken教授采用优化的角质细胞培养基培养釉质型颅咽管细胞,并证实过表达CNTTB1基因可促进肿瘤的迁移。在国内,2010年第二军医大学长征医院江荣才教授首次采用混合胰酶和胶原酶消化培养颅咽管瘤细胞,并证实博来霉素在体外抑制肿瘤细胞的增殖；2011年四川大学华西医院徐建国教授和罗林教授分别报道培养出颅咽管瘤原代细胞,前者证实生长激素促进肿瘤的增殖,而他莫昔芬则抑制肿瘤生长,后者证实维甲酸可诱导原代颅咽管瘤细胞凋亡。2013年,南方医科大学南方医院漆松涛教授继续改良细胞原代培养方法,摸索更适合颅咽管瘤细胞生长的培养基,体外培养可传6-9代。同年,华西医院游潮教授借鉴Holsken教授采用商品化的胶质细胞培养基不断完善颅咽管瘤细胞的培养。2015年,海军总医院田增民教授报道采用胰酶消化差速贴壁法,成功培养出颅咽管瘤细胞。以上为目前国内外文献报道的颅咽管瘤细胞培养方法,仔细深究,发现存在诸多问题：大部分文献报道的颅咽管瘤细胞培养仅局限于第1代；有些文献报道的颅咽管瘤细胞存在大量成纤维细胞污染；有些文献报道所培养的细胞实际上非颅咽管瘤细胞,而是肿瘤相关成纤维细胞；另外,各文献报道培养的颅咽管瘤细胞形态各异,即细胞的形态学与稳定性发生了相应的变化。所谓的永生化(cellimmortalization),是指体外培养的原代细胞经过自发的或受外界各个因素影响从而逃离,从增殖衰危机中逃离,从而具有无限稳定增殖的能力过程。原代培养细胞发生自发永生化的几率相当罕见,因此,人们努力通过基因转染等技术将外源性永生化基因,如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等,导人培养的原代细胞内,促进永生化的发生,从而建立稳定的永生化细胞株(immortalizedcell line),以达到细胞呈无限繁殖,而且保持与原代培养细胞的生物学特性。近几年来,研究发现细胞永生化与端粒酶的重新激活启动有密切联系。因此,通过病毒等方法转入外源性hTERT基因可直接激活细胞内的端粒酶从而使细胞获的永生。目前大量文献研究表明,通过病毒转入外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因已建立了相当多个增殖以及生态学稳定的细胞株,如内皮细胞、神经祖细胞、脑膜瘤、胃印戒细胞癌、前列腺上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、乳腺上皮细胞以及骨髓基质干细胞等,其中细胞端粒酶的活性重新激活,保持了原有培养细胞的形态学特征,无恶性转变。综上所述,优化颅咽管瘤的细胞原代培养,尤其是细胞生物学活性、形态以及稳定增殖至关重要；深入研究这类具有干细胞特性的涡轮转细胞,即颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞(CSLCs),对于解释釉质型颅咽管瘤的发生、发展以及与肿瘤的脑组织侵犯、肿瘤钙化尤为重要；在良好的原代细胞基础上,建立稳定的永生化颅咽管瘤细胞系对颅咽管瘤生物学特点、肿瘤的发生发展、病因机制、临床治疗措施等意义重大。研究内容与方法1、改良后的颅咽管瘤原代细胞培养及鉴定收集南方医科大学南方医院神经外科2015年1月至2015年12月颅咽管瘤手术标本85例,所有样本都经本院病理科确诊为颅咽管瘤。其中釉质型颅咽管瘤66例,鳞皮型颅咽管瘤19例；儿童占46例,成人占39例。85例标本都进行常规的脱水石蜡包埋。其中49例肿瘤组织因实质成分比较多,进行了颅咽管瘤细胞培养的方法改良,利用倒置显微镜对其原代及传代后的细胞进行拍照记录,前后培养的细胞进行反复对比,不断优化培养条件。选择传代后的培养细胞进行细胞免疫荧光鉴定,指标包括Pan-CK、VIM、 α-SAM,进一步明确颅咽管瘤上皮细胞和成纤维细胞,即肿瘤相关成纤维细胞。选择状态良好的传代后细胞进行细胞生物学特性实验,包括CCK-8细胞增殖实验、流式细胞技术检测细胞周期和凋亡。2、颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞(CSLCs)的培养、鉴定及多向分化潜能前面包埋的85例颅咽管瘤石蜡块,进行常规连续切片的免疫组化染色,指标包括CD133、CD44、β-catenin以及HE染色。正置显微镜下拍照,观察釉质型和鳞皮型的CD133、CD44、 β-catenin表达分布情况。前面培养纯化的颅咽管瘤细胞,传代后采用含有DMEM/F12(1:1)、LIF、 B12、EGF、bFGF、N2等添加因子的培养基进行细胞悬浮培养,每2-3天离心换液,不同时间段倒置显微镜下观察并拍照记录瘤球的形成与大小变化。培养2周后,细胞免疫荧光分别检测釉质型颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞(CSLCs)与普通颅咽管瘤细胞CD133、CD44以及β-catenin的表达情况,Western-blot及RT-PCR继续检测以上2种细胞CD133、CD44以及β-catenin的表达情况。待细胞长满70%时,采用细胞成骨诱导剂(培养基中含10 mmol/L, β-甘油磷酸钠,50 mg/L维生素C, 10nmol/L地塞米松)培养以上2种细胞,并维持诱导21天以上。诱导结束后茜素红S检测以上2种细胞成骨分化能力。3、颅咽管瘤永生化细胞株的初步摸索前期构建好过表达慢病毒并摸索病毒转染MOI值。选择状态良好的颅咽管瘤原代细胞,细胞贴壁长满60%-70%,换液后进行慢病毒转染过表达hTERT基因,转染24小时内换洗病毒转染液。转染48小时、72小时、96小时后,分别拍照、检测细胞绿色荧光的表达率及强度。最后利用RT-PCR的方法检测转染目基因细胞、空载转染细胞、未转染对照细胞的hTERT的mRNA水平变化。4、统计学方法采用SPSS 17.0统计学软件对以上实验结果进行相应的统计学分析。计量资料用X±SD表示,组间比较采用两独立样本t检验；多组间的比较采用One-Way ANOVA进行比较；对于独立样本率的比较采用卡方检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1、改良后的颅咽管瘤原代细胞培养及鉴定改良后的颅咽管瘤细胞原代培养,细胞活力好,呈稳定增长传代,可传4至9代；2种病理类型的颅咽管瘤细胞培养后形态学没有明显的差异,同一种病理类型的颅咽管瘤细胞不同个体之间形态学上存在小的差异,整体上细胞贴壁后的形态呈“铺路石样”排列；细胞培养纯化后,颅咽管瘤细胞免疫荧光Pan-CK阳性、VIM阴性、α-SAM阴性,颅咽管瘤相关成纤维细胞免疫荧光Pan-CK阴性、VIM阳性,α-SAM阳性。细胞增殖曲线呈“S”型生长,不同细胞之间的生长曲线存在差异。颅咽管瘤原代细胞前3代大部分细胞处于S期。2、釉质型颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞的培养和多项分化潜能免疫组化显示釉质型颅咽管组织瘤涡轮状细胞共表达β-catenin入核与肿瘤干细胞标志物CD133、CD44,而肿瘤其它部位细胞不表达CD133、CD44及β-catenin入核,鳞皮型颅咽管瘤不表达CD133、CD44及β-catenin入核；采用干细胞悬浮瘤球方法培养2周后,釉质型可见大量大小不一的干细胞瘤球形成,而鳞皮型培养2周后未见有干细胞瘤球形成(P=0.006)；细胞免疫荧光显示瘤球贴壁后共表达β-catenin入核与肿瘤干细胞标志物CD133、CD44,普通釉质型颅咽管瘤细胞仅P-catenin胞膜表达,肿瘤干细胞标志物CD133、CD44阴性；Western-blot显示干细胞瘤球和普通细胞的干细胞标志物CD133、CD44及β-catenin的蛋白水平表达都具有显著差异(P＜0.001; P< 0.001; P=0.024); QT-PCR检测干细胞瘤球和普通细胞CD133、CD44及β-catenin的mRNA表达水平都具有显著差异(P<0.001；P<0.001；P=0.001)；成骨诱导培养21天后,颅咽管瘤肿瘤干细胞样细胞对比普通颅咽管瘤细胞,茜素红染色显著强阳性。3、颅咽管瘤永生化细胞株的初步摸索状态良好的颅咽管瘤原代细胞慢病毒转染hTERT 48小时、72小时、96小时后的荧光表达率大约分别是13%、54%、89%,目前转然后已传7代,细胞状态依旧良好。转染目的基因的细胞hTERT的mRNA水平明显高于未转染对照组细胞。结论改良后的颅咽管瘤原代培养,其形态与活性明显优于目前国内外文献所报道的其它方法,为以后深入基础研究提供了更好的平台,也是建立稳定永生化细胞系的前提与基础：首次在细胞学层面证实釉质型颅咽管瘤存在CSLCs,肿瘤干细胞具有多项分化潜能,为解释釉质型颅咽管瘤病理多样性做好前期工作；另外CSLCs为我们下一步进行肿瘤炎症释放、脑组织侵犯、放化疗抵抗研究奠定基础；颅咽管瘤永生化细胞系初步探索,这些实验的进展将为后期颅咽管瘤的深入研究奠定夯实基础。