奶牛场常通过饲喂高精料以满足高产奶量的市场需求,但是精料含量过高会使得日粮中有效物理纤维含量减少,降低瘤胃发酵,造成瘤胃内挥发性脂肪酸的积聚,降低瘤胃pH值,当瘤胃内pH值下降到一定程度会引发亚急性瘤胃酸中毒(SARA)的发生。而过低的瘤胃pH会造成瘤胃内革兰氏阴性菌的增殖崩解,从而释放大量的游离脂多醣内毒素(LPS)。LPS经门静脉进入肝脏,超过肝脏的清除能力时,即造成肝脏的炎性损伤,刺激肝脏分泌急性期蛋白,进而引发全身性急性期反应。因此,本文主要研究高精料日粮对奶牛肝脏的炎性损伤,以及对高精料引发的SARA的调控措施。1.高精料日粮对奶牛肝藏的炎性损伤高精料日粮使瘤胃内pH值下降,革兰氏阴性菌裂解释放LPS。LPS经门静脉进入肝脏,超过肝脏的清除能力时会影响肝脏的营养代谢和免疫功能。本试验采用8头泌乳期荷斯坦奶牛,安装瘤胃瘘管和肝静脉、门静脉、颈静脉血管插管。以40%精料含量的日粮饲喂四周后,将奶牛随机分成两组:高精料组(精粗比6:4,n=4)作为处理组,低精料组(精粗比4:6,n=4)作为对照组。饲喂8周后,采集瘤胃液、肝静脉、门静脉和颈静脉血液样品以及肝脏活体取样。检测结果发现,与低精料组相比,高精料组瘤胃液pH值显著下降并低于5.6的持续时间超过3 h,意味着SARA的发生。高精料组肝脏发生炎性细胞浸润,肝细胞肿胀变性。同时,高精料组免疫相关基因TRAF3、TRAF6、TBK、ERK、p38以及IL-6在肝脏内的mRNA相对表达量显著高于低精料组(p<0.05)。蛋白NF-κB、p38在肝脏内的活化显著高于低精料组。另外,高精料组外周血中促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度显著高于低精料组(p<0.01)。结果表明高精料使LPS在奶牛肝脏聚积,并激活NF-κB、p38MAPK信号通路,促进促炎性细胞因子的释放,并对奶牛肝脏造成了一定程度的炎性损伤。2.高精料日粮对奶牛瘤胃内容物中微生物区系的影响增加精料含量会使日粮中纤维含量下降,进而影响瘤胃内容物中微生物区系的变化。本试验采用12头泌乳期荷斯坦奶牛,安装瘤胃瘘管和门静脉血管插管,以40%精料的日粮术后护理四周后,将奶牛随机分成两组:高精料组(精粗比6:4,n=6)和低精料组(精粗比4:6,n=6)。八周后,采集瘤胃内容物样品,检测瘤胃游离LPS值,并用16s rRNA的方法进行微生物高通量测序。结果发现,高精料组瘤胃LPS含量显著高于低精料组(p<0.01)。另外,高精料日粮使瘤胃微生物组成发生改变,拟杆菌门相对丰度下降,其中普氏菌科的霍氏菌属(p<0.01)、普氏菌属(p=0.04)和未经分类的普氏菌属(p=0.01)相对丰度显著降低,但是未经分类的拟杆菌科却显著升高(p=0.027)。与低精料组相比,高精料组厚壁菌门含量显著上升,其中未经分类的毛螺菌(p<0.001)、颤杆菌克(p=0.007)、瘤胃球菌(p=0.015)、未经分类的梭菌属(p=0.037)显著升高,而胞杆菌(p=0.012)和琥珀酸菌(p=0.006)显著下降。说明高精料日粮使纤维分解菌的相对丰度降低,并允许厚壁菌门及其他机会性菌的增殖,进而导致瘤胃内游离LPS浓度升高。3.日粮改变对奶山羊SARA的调控作用改变日粮颗粒大小可以改变瘤胃发酵功能,并且在饲喂高谷物日粮时降低反刍动物患瘤胃疾病的风险。本试验采用8只泌乳中期的奶山羊,安装瘤胃瘘管、肝静脉、门静脉和颈静脉血管插管后随机分成两组,一组饲喂高精料日粮(粉料,精粗比6:4,n=4)作为对照组,另一组饲喂综合调控日粮(颗粒料,精粗比6:4,按比例2:3:5:5加入氧化镁、碳酸氢钠、乙酸钠和丁酸钠作为缓冲剂,n=4)作为处理组。饲喂20周后,采集瘤胃液、肝静脉、门静脉和外周血液以及肝脏活体取样。经检测结果发现,综合调控日粮使奶山羊瘤胃内pH值显著升高,且<5.8的持续时间为0,并使门静脉、肝静脉内LPS浓度显著下降。另外,综合调控日粮使肝脏内免疫基因IKK、IκB、转录因子NF-κB、促炎性细胞因子IL-1β、抗炎性细胞因子IL-10以及急性期蛋白LBP的mRNA相对表达量以及NF-κB、ERK的蛋白活化情况显著低于对照组。同时,综合调控日粮使外周血中促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的浓度显著降低。且肝脏内p38、ERK的蛋白活化情况与进入肝脏的LPS浓度正相关。说明改变日粮颗粒大小并添加缓冲剂可以降低奶山羊对高精料日粮的免疫反应,对控制奶山羊SARA的发生具有指导意义。4.酵母发酵产物对SARA状态下奶牛瘤胃、粪便中LPS浓度以及急性期反应的影响目前,已有研究在日粮中添加酵母发酵产物来缓解或控制奶牛场SARA的发生,但各个研究结果并不一致。本试验采用安装了瘤胃瘘管的12头奶牛,以45%的精料含量日粮饲喂。而后从分娩前三周开始将奶牛随机分成两组,对照组添加140 g/d的玉米,处理组添加126 g/d玉米混合14 g/d酵母发酵产物。在分娩后第5周进行SARA诱导,将精料含量提高到70%,每周采集瘤胃液、粪便和外周血液样品,试验持续到分娩后第七周结束。结果发现,70%精料含量的日粮使奶牛瘤胃pH显著下降并且<5.6的持续时间大于3 h,表示SARA的成功诱导,并且瘤胃液和粪便中游离LPS浓度以及外周血中急性期蛋白SAA、Hp的浓度也升高。但是处理组瘤胃液LPS浓度在SARA周的升高受到一定程度的限制,并且SARA诱导结束后急性期蛋白SAA、LBP的下降较对照组明显。另外,瘤胃液LPS与粪便LPS和外周血SAA、Hp之间呈现了显著的正相关性,说明粪便LPS和急性期蛋白的浓度会随着瘤胃LPS的变化而变化。因此,高精料会导致奶牛机体发生急性期反应,而添加酵母发酵产物对高精料诱导的SARA的调控作用并不显著。5.增加日粮中酵母发酵产物含量对SARA状态下奶牛体内急性期反应的影响有研究报道酵母发酵产物可以影响瘤胃内微生物的生长,稳定瘤胃pH,对瘤胃纤维降解和整个消化道的营养吸收都能发挥作用。基于上一章研究内容,本研究采用18头安装瘤胃痿管的泌乳期奶牛,同样从分娩前三周开始改变日粮成分,并随机分成三组,对照组(140 g/d玉米)、SCFP1组(121 g/d玉米混合19 g/d的酵母发酵产物)、SCFP2组(102 g/d玉米混合38 g/d的酵母发酵产物)(n==6)。分娩后第五周进行SARA诱导,试验持续到分娩后第七周结束。采集瘤胃液、粪便和外周血液样品,进行瘤胃、粪便LPS分析和外周血急性期蛋白分析。结果发现,SARA诱导使瘤胃pH显著下降(p<0.01),瘤胃和粪便中LPS浓度显著升高(p<0.01),血浆急性期蛋白SAA、Hp浓度显著升高(p<0.05)。但增加酵母发酵产物并不能明显减缓瘤胃pH的下降,对粪便中LPS的浓度也没有影响,却有降低瘤胃LPS浓度的趋势(p=0.07)。另外,SARA诱导结束后,酵母发酵产物可以使外周血中SAA、Hp和LBP的浓度尽快恢复到正常水平,而且随着含量的增加,其效应更加明显。与对照组相比,SARA诱导结束两周后,SCFP2 组 SAA(p=0.05)、Hp(p=0.06)和 LBP(p=0.04)的含量显著减少,而SCFP1组SAA(p=0.41),Hp(p=0.50)和LBP(p=0.06)的下降并不显著。瘤胃LPS与粪便LPS和外周血急性期蛋白之间存在显著相关性。本研究进一步证实了增加酵母发酵产物添加量可以帮助奶牛提高机体抗损伤的能力且有微弱的剂量依赖性。