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目的:Tudor-SN(Tudor Staphylococcal Nuclease)蛋白,又称为p100、SND1(staphylococcal nuclease domain containing 1),广泛存在于人类、动植物中,可参与基因转录、细胞应激、pre-mRNA剪切等多种生物学过程。本课题组的前期研究结果表明当真核细胞受到外界刺激,如0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克时,Tudor-SN蛋白可以在细胞胞浆中形成颗粒状聚集,参与应激颗粒(Stress Granules,SGs)的构成。SGs是真核细胞受到氧化应激、热休克、病毒感染等各种环境刺激时在胞浆中产生的颗粒状结构,与mRNA代谢密切相关。本课题旨在深入探讨Tudor-SN蛋白的真核细胞应激生物学行为机制,主要关注应激状态下Tudor-SN蛋白的亚细胞定位与磷酸化分析。方法:本课题实验分为三部分,第一部分主要利用细胞免疫荧光(immunofluorescence,IF)技术分析不同应激条件、不同细胞周期时相HeLa细胞内Tudor-SN颗粒的形成情况,以及Tudor-SN应激颗粒与细胞器、自噬颗粒的共定位关系;第二部分主要利用LI-COR Odyssey(?)近红外双色激光成像系统和传统的Western Blotting技术分析在0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克的应激条件时HeLa细胞内Tudor-SN蛋白的表达情况及其总体丝氨酸(Serine,Ser)、苏氨酸(Threonine,Thr)和酪氨酸(Tyrosine,Tyr)的磷酸化水平;第三部分主要是通过液相串联质谱(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry,LC-MS/MS)技术确定与 0.5mM 亚砷酸钠氧化应激相关的Tudor-SN蛋白磷酸化位点,进而合成相应的磷酸化多肽,免疫新西兰大白兔后收集血清获取抗Tudor-SN特定位点的磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的相关分析。结果:1)在给予细胞10mM DTT(二硫苏糖醇,Dithiothreitol)刺激时,Tudor-SN蛋白可在胞浆中形成应激颗粒,但当给予4℃冷处理1h、32℃冷处理20h以及20mM H2O2氧化应激1h、1μM毒胡萝卜素处理2h时均未发现Tudor-SN应激颗粒的形成;2)Tudor-SN蛋白应激颗粒并不与高尔基体、线粒体、内质网及自噬颗粒存在共定位关系;3)Tudor-SN蛋白应激颗粒在细胞周期的有丝分裂前期(Prophase)、前中期(Prometaphase)、中期(Metaphase)、后期(Anaphase)逐渐解聚消失,末期(Telophase)恢复;4)当细胞受到0.5mM亚砷酸钠氧化应激或45℃热休克处理时Tudor-SN蛋白表达水平没有变化,但总体Ser、Thr和Tyr的磷酸化水平升高;5)0.5mM亚砷酸钠氧化应激状态下Tudor-SN蛋白T73、T103位点可被磷酸化,并针对这两个位点制备兔源多克隆磷酸化抗体,包括抗pT73、抗pT103抗体;6)抗pT103抗体可以检测到细胞内Tudor-SN应激颗粒信号;7)HeLa细胞受到亚砷酸钠氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论:1)Tudor-SN蛋白参与细胞应激具有一定的应激条件依赖性,且随着细胞周期时相性发生变化;2)Tudor-SN应激颗粒在形态学上有别于细胞内高尔基体、线粒体、内质网及自噬颗粒结构;3)成功制备针对T73、T103位点的兔源多克隆Tudor-SN应激磷酸化抗体;4)当细胞受到应激时,Tudor-SN蛋白T103位点磷酸化水平非线性升高,参与细胞Tudor-SN应激颗粒的形成。