研究背景:恶性肿瘤已成为威胁人类健康的第二号杀手。化疗是肿瘤术后治疗的重要辅助方案,但传统化疗药物缺乏肿瘤选择性,对肿瘤病人的正常细胞也具有很强的毒副作用,并且长期使用会导致化疗耐药性,严重影响了化疗的治疗效果。基因治疗协同化疗可有效增强药效,进一步研究发现,基因治疗联合化疗中,基因与化疗药物的施药顺序、用药间隔对肿瘤抑制效果有极大的影响。对于MDA-MB-231乳腺癌细胞,最大的抑制率出现在先施用mi R-21抑制剂4小时后再施用阿霉素,而同时施药或先施用阿霉素却表现出拮抗作用,联合用药对肿瘤细胞的抑制率反而低于单独用药。这一研究结果表明,基因治疗联合化疗必须重视用药时间和用药序列问题,即联合治疗的时序问题,这就对药物载体提出了更高的要求:一要实现基因/化疗药物同载,使得基因与化疗药物投递到同一肿瘤细胞中发挥药效;二要控制基因与化疗药物的时序性释放,实现时序性联合治疗,而目前研究中的载体并不能满足时序性的要求。本课题构建了以金纳米空心球为基础的时序控制释放体系,应用其等离子共振对近红外光强吸收的特点,实现了mi RNA和化疗药物DOX的精确释放,并通过体内及体外实验验证其肿瘤抑制效果,为临床应用提供理论依据。研究方法:(一)材料的制备及表征1)以银离子为模板进行置换反应制备金纳米球载体HGPAD;2)用树形大分子PAMAM修饰金纳米球得到HGNPs,实现与micro RNA的连接通路;3)采用静电吸附的方法实现HGNPs对化疗药物盐酸阿霉素的共载得到HGPAD;4)通过MDA-MB-231细胞验证在as-mi R-21和DOX不同时序处理下的细胞抑制率;5)制备好样品后用透射电镜、紫外光吸收等方法对纳米材料进行表征;(二)细胞水平验证纳米材料对肿瘤细胞的杀死作用及其机制1)以IC50、MTT实验来验证基因与药物时序治疗相对于游离药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度的变化;2)提取DNA和RNA,用荧光定量PCR技术在基因水平验证mi RNA对肿瘤细胞的抑制作用;3)以免疫荧光实验和western blot实验验证纳米材料对肿瘤抑制作用的机制;(三)采用裸鼠皮下瘤模型验证纳米药物对肿瘤的抑制作用1)给4-6周龄的裸鼠皮下接种肿瘤细胞,建立小鼠荷瘤模型;2)周期性给成瘤模型的裸鼠尾静脉注射纳米药物,并用红外光照射刺激纳米药物实现时序释放;3)定期量取肿瘤体积和小鼠体重,对纳米药物的抑制作用进行评估;4)用小动物成像技术定位纳米材料在小鼠体内的分布,确定其肿瘤靶向性;5)处死小鼠后取主要的脏器及肿瘤组织进行HE染色,观察纳米药物的生物毒性;结果:1)通过银离子置换反应制备近红外光响应的金纳米空心球,用树形分子基因载体PAMAM修饰金纳米球得到HGPA,粒径86nm,性质稳定,可与化疗药物阿霉素通过正负电荷吸附作用结合得到HGPAD,模拟体内环境下可稳定释放as-mi R-21,并响应近红外光激发实现阿霉素控释,达到了基因/药物时序释放的目的。2)相比于游离药物DOX组,基因/药物时序联合治疗组降低了乳腺癌细胞MDA-MB-231半数抑制浓度9倍,同时共聚焦显微镜显示时序治疗组大大增加了细胞内的药物积累量,通过流式细胞术及免疫荧光实验证实时序治疗可以诱导细胞色素C从线粒体释放至胞浆,诱导细胞凋亡。3)western blot证实时序治疗组可引起两方面的细胞凋亡机制,包括细胞膜凋亡通路Fas L-Fas和线粒体凋亡cytochrom C激活caspase家族蛋白表达。4)游离DOX不能抑制裸鼠皮下乳腺癌移植瘤的生长,时序联合治疗组治疗3周期间肿瘤几乎没有生长,说明基因/药物时序联合治疗具有很好的抑瘤效果。5)乳腺癌皮下成瘤裸鼠尾静脉注射HGNPs 4小时后可以观察到几乎全部的HGNPs聚集在肿瘤部位,24小时后肿瘤部位依然有非常强的荧光信号,说明HGNPs具有很好的肿瘤滞留性。HE染色结果表明时序治疗组除肿瘤部位外对主要脏器没有毒性,说明HGNPs是安全无毒有效的药物投递系统。结论：本文构建了以金纳米空心球为载体的基因/药物时序联合治疗纳米投递系统,通过金纳米空心球等离子共振效应实现基因/药物时序释放,具有较好的抑制肿瘤生长的效果,并具有较高的生物安全性,在临床方面有较好的应用前景。