本研究以传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌WF83株为亲本株，用卡那霉素抗性基因置换缺失完整的apxIIC基因，使构建的突变株产生的ApxII因不能被apxIIC基因编码的蛋白ApxIIC乙酰基化而失去原有的溶血活性和细胞毒性，实现了ApxII的减毒，并对该减毒株的生物学特性和免疫保护效力进行了研究。 1.重组转移载体pBSKA的构建 根据Prideaux等(1999)的引物和传染性胸膜肺炎放线杆菌血清7型菌(APP-7)L25-4株的apxII操纵子的部分序列设计并合成了两对引物，从APP-7WF83株PCR扩增apxIIC基因上游2,200bp左右的片段作为左同源臂，将该片段与pBS-T载体连接，选择正向克隆质粒，命名为pBSL;PCR.扩增apxIIC基因下游1，000bp左右的片段作为右同源臂，将该片段与pMD19-TSimpie载体连接，得到克隆质粒，命名为pMD19-SR。根据pEGFP-N1序列设计并合成了一对引物，从pEGFP-N1PCR扩增800bp左右的卡那霉素抗性基因，将该片段与pMD19-TSimple载体连接，得到克隆质粒，命名为pMD19-K。另外，质粒pMD19-K经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切消化得到卡那霉素抗性基因，克隆到pBSL中的EcoRⅠ和BamHⅠ位点，获得中间载体pBSLK；质粒pMD19-SR经BamHⅠ和SacⅠ酶切消化得到右同源臂，克隆到pBSLK中的BamHⅠ和SacⅠ位点，获得了重组转移载体pBSKA。 2.传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIIC-/kanr+基因缺失减毒株的构建及筛选鉴定 重组转移载体pBSKA通过电转化导入亲本菌APP-7WF83株，电转化后的产物涂布于TSB/Kan平板，1-2d可获得突变株。卡那霉素抗性试验证实突变株有卡那霉素抗性；NAD依赖性试验证实突变株依赖NAD生长；PCR鉴定证实了卡那霉素抗性基因置换了完整的apxIIC基因，并证实突变株中无pBSKA质粒的存在；溶血活性试验证实突变株体外培养不表现溶血活性：细胞毒性试验证实突变株的细胞毒性完全丧失；对小鼠的安全性试验证实突变株的毒力显著减弱，突变株对小鼠是安全的。遗传稳定性试验证实突变株在体外连续传30代或在体内传10代不会发生卡那霉素抗性的丢失。这表明我们所构建的基因缺失减毒株是成功的，为进一步以此突变株作为基因工程弱毒活疫苗株的研究奠定了一定的基础。 3.传染性胸膜肺炎放线杆菌apxIIC-/kanr+基因缺失减毒株免疫保护效力的初步研究 本实验将基因缺失减毒株apxIIC-/kanr+(活菌含量1.1×108CFU)通过背部皮下免疫小鼠，间隔两周，免疫两次。当第二次免疫14d后，用致死剂量的血清1型(活菌含量3.4×107CFU)、血清5型(活菌含量6.8×107CFU)和血清7型菌(活菌含量1.1×109CFU)对免疫小鼠进行攻毒。结果基因缺失减毒株apxIIC-/kanr+免疫小鼠对1、5、7型菌攻击的保护率均为100％(10/10)。小鼠免疫和攻毒试验结果初步显示，基因缺失减毒株免疫小鼠对同源血清型和异源血清型菌攻击的免疫保护效果均较好，具有良好的应用前景。