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研究背景槲皮素(quercetin,QUE)是多种中药材中存在的单体活性成分,属于多羟基黄酮类化合物。已证实QUE通过抗炎和抗氧化作用而参与心肌肥厚和动脉粥样硬化等疾病的调控,但其在甲亢引起的心血管损伤的保护作用目前尚不明确。目的探讨QUE对甲亢致心血管损伤的保护作用及机制,为甲亢性心血管疾病的防治提供理论依据。方法(1)甲亢大鼠模型的建立:颈后皮下注射L-甲状腺素钠(0.05 mg/kg)2周。(2)实验分组:对照组、T4组、QUE-L+T4组、QUE-M+T4组、QUE-H+T4组。QUE的三种不同灌胃浓度L、M、H分别为10、30、60 mg/kg,T4注射前2周开始灌胃。(3)心率血压检测:无创尾动脉检测技术检测大鼠。(4)血浆活性成分检测:利用放射免疫法检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),利用硝酸还原酶法检测一氧化氮(nitric oxide,NO),利用丙酮酸二硝基苯腙法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH),利用WST-1法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。(5)组织形态观察:HE染色法观察心脏组织和主动脉。(6)心房动力及ANP分泌水平检测:利用离体大鼠心房灌流测量心房内压,利用放射免疫技术检测心房灌流中的ANP水平。(7)ANP/NO信号相关蛋白检测:蛋白印迹法检测心脏组织及主动脉中NPR-A、Akt/eNOS的表达。(8)细胞生存率检测:MTT法检测细胞存活率。(9)细胞NO分泌检测:细胞培养液用硝酸还原酶法检测NO水平。(10)细胞凋亡检测:采用Annexin V-FITC和PI双染色法检测细胞凋亡。结果1.QUE对甲亢大鼠血流动力学和血浆活性成分的影响(1)T4组大鼠的心体比、心率和血压较对照组相比显著升高,QUE对甲亢大鼠的心体比、心率、血压的异常升高有改善作用。(2)血浆活性成分:T4组大鼠血浆SOD水平较对照组显著降低,QUE干预甲亢大鼠血浆SOD水平有升高作用;T4组大鼠血浆NO水平较对照组显著降低,QUE干预甲亢大鼠血浆NO水平有升高作用;T4组大鼠血浆LDH水平较对照组显著升高,QUE干预甲亢大鼠血浆LDH水平有降低作用;T4组大鼠血浆ANP水平较对照组显著降低,QUE干预甲亢大鼠血浆中ANP水平有升高作用。2.QUE对甲亢致心脏损伤的保护作用及机制(1)心脏组织HE染色:甲亢大鼠的心肌肥厚,受损严重,心肌间隙变大,心肌细胞排列紊乱,QUE对甲亢大鼠心肌组织的此损伤有抑制作用。(2)心房内压检测:使用QUE 60 mg/kg时对正常大鼠心房内压有降低作用;使用QUE10、30、60 mg/kg时较对照组ACh促心房内压降低的作用增强;T4组大鼠ACh促心房内压变化较对照组显著降低,使用QUE 60 mg/kg干预时ACh促心房内压变化显著增加;T4组大鼠ACh促进心房ANP分泌的作用较对照组显著减弱,使用QUE 60 mg/kg干预时ACh促进心房ANP分泌的作用显著增加。(3)心肌组织中蛋白表达:T4组大鼠心肌组织中NPR-A的表达较对照组明显降低,QUE干预组心肌组织NPR-A的表达显著增加;T4组大鼠心肌组织中Akt、p-Akt的表达较对照组明显降低,QUE干预组心肌组织Akt、p-Akt的表达显著增加;T4组大鼠心肌组织中eNOS、p-eNOS的表达较对照组明显降低,QUE干预组心肌组织eNOS、p-eNOS的表达显著增加;提示QUE增加甲亢大鼠心肌组织eNOS-NO信号通路蛋白的表达。(4)H9C2细胞存活率检测:0-20μM QUE对H9C2存活率无影响,而10μM T4明显抑制H9C2的细胞生存,QUE干预能改善10μM T4致H9C2存活降低。(5)H9C2细胞培养液中NO检测:T4组NO水平较对照组显著低,QUE升高T4刺激H9C2培养液中NO水平。提示QUE通过ANP和NO信号通路保护甲亢致心脏损伤作用。3.QUE对甲亢致血管损伤的保护作用及机制(1)主动脉HE染色:甲亢大鼠胸主动脉变形严重,薄厚不一,且已看不到完整的内皮层,纤维层弹性消失,并且细胞核排列紊乱,而QUE处理大鼠主动脉内皮层有很大程度的恢复,血管内层呈现完整内皮。(2)胸主动脉中蛋白检测:T4组大鼠胸主动脉中NPR-A的表达较对照组明显降低,QUE干预组胸主动脉中NPR-A的表达显著增加;T4组大鼠胸主动脉中Akt、p-Akt的表达较对照组明显降低,QUE干预组胸主动脉Akt、p-Akt的表达显著增加;T4组大鼠胸主动脉中eNOS、p-eNOS的表达较对照组明显降低,QUE干预组胸主动脉eNOS、p-eNOS的表达显著增加;提示QUE增加甲亢大鼠胸主动脉eNOS-NO信号通路蛋白的表达。结果提示,QUE提高甲亢大鼠NPR-A的表达量,同时有可能激活增加eNOS-NO信号通路蛋白的表达。(3)HUVECs细胞存活率检测:0-10μM QUE对HUVECs的存活率无影响,5μM T4明显抑制HUVECs的细胞活力,QUE改善5μM T4致HUVECs的存活率下降。(4)HUVECs细胞培养液中NO检测:T4组NO水平较对照组显著降低,QUE升高T4刺激HUVECs培养液中NO水平。(5)HUVECs细胞凋亡检测:QUE降低5μM T4致HUVECs凋亡率。提示QUE通过ANP和NO信号通路保护甲亢致血管损伤作用。结论QUE通过ANP和NO信号通路,发挥其对甲亢大鼠心血管的保护作用。