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谷胱甘肽（glutathione,GSH）因其具有良好的营养价值、抗氧化性和解毒功能而被广泛运用于食品、化妆品和医药行业。目前生产谷胱甘肽最主要的方法是微生物发酵法。与传统的化学合成法和酶法相比,该方法具有生产成本低、操作简单、无需外源添加ATP和辅助因子等优势。重组毕赤酵母（Pichia pastoris）由于蛋白表达量高、易实现高密度培养等优点,已初步显示出在工业上生产谷胱甘肽的价值。本研究以异源表达来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）S288c的谷胱甘肽酶基因（gsh1和gsh2）的重组毕赤酵母GS115为出发菌株,从诱变育种、拷贝数的筛选、产物分解代谢途径的改造、外源基因的整合和摇瓶发酵条件的优化这些方面来提高产物谷胱甘肽的合成效率。主要研究内容及结论如下:（1）将重组毕赤酵母GS115进行紫外和甲基磺酸乙酯复合诱变,以谷胱甘肽类似物乙硫氨酸作为筛选剂。将紫外诱变的时间设置为40 s,甲基磺酸乙酯诱变剂的浓度为0.4 mg·mL-1,乙硫氨酸筛选剂的浓度为0.8 g·L-1,筛选后获得一株稳定遗传的正向突变株GS115-M7,其GSH产量达到1124 mg·L-1,与出发菌株产量相比提高了37.5%,其单位菌体GSH产量达到100.6 mg·g-1,比出发菌株高43.7%。（2）构建了含有酿酒酵母S288c来源的谷胱甘肽合成酶基因gsh1和gsh2的重组表达质粒,将该质粒通过5’AOX1位点同源重组整合到目标菌株基因组上。逐步提高G418抗生素浓度来筛选高拷贝重组菌株。最终获得一株可稳定遗传的重组菌株GS115-M710,其GSH产量可达到1613 mg·L-1,比诱变后的正向突变株产量提高45.5%,其单位菌体产量达到150.75 mg·g-1,提高了49.9%。（3）通过CRISPR/Cas9技术分别敲除了谷胱甘肽分解代谢途径中的三个酶基因（dug1/2/3）,并考察了其对重组菌株生长和产GSH能力的影响。结果表明,敲除dug基因使单位质量酵母中的GSH含量增加,但影响了酵母的生长,其中dug1、dug2和dug3敲除菌株的GSH产量分别为1510 mg·L-1、1669 mg·L-1、1620 mg·L-1,单位菌体产量依次为206 mg·g-1、215.6 mg·g-1、223.1 mg·g-1,分别比对照提高35.5%、41.9%、47%。（4）构建了含有透明颤菌血红蛋白vgb基因的酵母整合表达质粒,将该重组质粒通过3’AOX1位点同源重组整合到菌株GS115-M710基因组上,并通过潮霉素抗性筛选和PCR验证获得成功插入vgb基因的重组菌株GS115-M710V。在摇瓶装液量为20/250mL时,含有vgb基因的重组酵母生长明显好于对照菌株,GSH的产量达到了1824 mg·L-1。在装液量为40/250 mL时,重组菌株的生长仍然略好于对照菌株,其单位菌体产量达到157.4 mg·g-1。（5）以重组菌株GS115-M710V为生产菌株,优化发酵培养基和环境条件确定了发酵培养基中三种前体氨基酸的初始添加量为谷氨酸81 mmol·L-1、甘氨酸27 mmol·L-1、半胱氨酸13.5 mmol·L-1,底物补充量确定为谷氨酸:甘氨酸:半胱氨酸=9:9:20 mmol·L-1。其次考察了环境条件对重组毕赤酵母发酵的影响,确定了摇瓶水平下的最佳发酵条件:接种量10%,补料时间点40 h,采用分阶段控温策略,前期30℃,发酵40 h后调整至26℃直至发酵结束。经过发酵优化后,GSH的产量和单位菌体产量分别达到了1884mg·L-1、166.7 mg·g-1。