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1.探讨了水牛精子质膜的完整性、破损精子质膜的方法、洗精液和注射温度对水牛ICSI介导转基因(ICSI-Mediated Gene Dansfer,ICSI-Tr)效果的影响。结果发现:(1)以冻融方法破损精子质膜组早期胚胎基因表达率为21.8％,显著高于活精子组的5.1％(P＜0.01),而分裂率、囊胚发育率均无显著差异(P>0.05);(2)以冻融、TritonX100、超声波三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率(16.7％)最高,且显著高于TritonX100组(P＜0.01)。同时,冻融组的早期胚胎转基因表达率亦显著高于TritonX100组和超声断尾组(60.3％比31.7％比18.2％,P＜0.05);(3)以杜氏磷酸缓冲液(DulbeccosPhosphate Buffered Saline,DPBS)、精核分离液(Nucleus Isolation Medium,NIM)、细胞清洗液(Cell Cleaning Medium,CCM)三种不同培养液洗涤水牛精子,DPBS组早期胚胎基因表达率、囊胚转基因表达率均显著低于NIM、CCM组(3.8％比36.4％比46.9％,P＜0.01:0比26.1％比43.8％,P＜0.01),其囊胚发育率则显著高于CCM组(21.3％比10.O％,P＜0.05),NIM与CCM组之间各项指标均无显著差异;(4)当分别在25℃、38℃时显微注射,两组间的转基因效果无显著差异,但在38℃注射显著降低分裂率和囊胚发育率(69.4％比90.5％,P＜0.01;5.6％比16.8％,P＜0.05)。以上结果表明,(1)使用ICSI介导转基因技术可获得表达EGFP基因的水牛早期胚胎;(2)精子质膜是阻碍外源DNA与水牛精子结合的主要因素,冻融精子质膜破损法能有效破损精子质膜,有利于外源DNA与精子的结合,提高转基因效率;(3)不同的洗精液对水牛ICSI介导转基因的效果有影响;(4)注射温度对水牛ICSI胚胎的发育有影响,但对ICSI介导转基因的效果无影响。
2.探讨了外源DNA的浓度、构型和制备方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。将线性pEGFP-N1质粒DNA分成0.6、3.0、15.0、75.0μg/mL四个梯度分别进行水牛ICSI介导转基因试验,结果显示,3.0μg/mL组的早期胚胎基因表达率最高,且显著高于0.6μg/mL组和75.0μg/mL组(45.3％比26.3％比21.0％,P＜0.05)。同时,3.0μg/mL组囊胚基因表达率(56.3％)亦最高,且显著高于75.0μG/mL组(56.3％比12.5％,P＜0.05)。当使用环状pEGFP-N1质粒DNA进行水牛ICSI介导转基因试验时,早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率、囊胚发育率等几项指标与线性。EGFP质粒组无显著差异(P>0.05)。而使用PCR直接扩增CMV-EGFP-SV40-NEO得到的DNA用于试验时,没有获得EGFP表达的水牛ICSI胚胎。以上结果表明:(1)外源基因的浓度会影响水牛ICSI介导转基因的效果,pEGFP-N1质粒DNA的浓度以3.0μg/mL为宜;(2)在水牛ICSI介导转基因时,环状与线性EGFP质粒DNA的效果相当;(3)用PCR直接扩增外源基因片段进行水牛ICSI介导转基因得不到表达结果。
3.探讨了不同激活方法对水牛ICSI介导转基因效果的影响。ICSI的水牛卵母细胞用5μmol/L的离子霉素(Ionomycin,Ion)激活处理5min后分成3组,然后分别用10μg/mL放线菌酮(cycloheximide,CHX)培养5h,10μg/mL CHX培养3h后再用2mmol/L的二甲氨基嘌呤(6-DMAP)培养2h(CHX3hDMAP2h)或用培养液(CM)培养3h后再用2mmol/L6-DMAP培养2h(CM3h-DMAP2h)。结果显示,CHX5h组的分裂率、早期胚胎基因表达率、囊胚发育率最高,且显著高于CM3h-DMAP2h组(66.7％比49.5％,P＜0.05;66.7％比40.0％,P＜0.01;22.2％比9.9％,P＜0.05)。ICSI18h后检查原核形成率,发现CHX5h和CHX3h-DMAP2h处理组的完整精子头百分率显著低于CM3h-DMAP2h处理组(P＜0.05),2原核(PN)百分率则显著提高(42.4％比23.8％,P＜0.05;44.6％比23.8％,P＜0.01)。此外,还探讨了使用还原剂β-巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇(DTT)、谷胱甘肽(GSH)减少精核二硫键对水牛ICSI介导转基因效果的影响。在进行ICSI介导转基因前,分别用0.5mmol/Lβ-ME、5.0mmol/L DTT、0.25mmol/L GSH预处理水牛精子1h,以减少水牛精核二硫键,结果显示β-ME、DTT、GSH预处理水牛精子对提高ICSI介导转基因的效果不显著,但GSH能显著提高2PN的形成率(P＜0.05)。以上结果表明:(1)在水牛ICSI介导转基因时,Ion联合CHX较Ion联合6.DMAP激活效果好;(2)在水牛ICSI介导转基因时,还原剂β-ME、DTT、GSH预处理精子对提高水牛ICSI介导转基因的效果不显著,但还原剂GSH预处理精子能显著提高2PN的形成率。
4.探讨了ICSI-Tr生产转Fat-1基因水牛的可行性。首先,构建了pPGK1-FAT1-CMV-EGFP载体,并使用该载体进行ICSI介导转Fat-1基因的研究。通过荧光显微镜观察EGFP的表达情况,确认标记基因能在水牛ICSI介导转基因的早期胚胎中表达,并确定25μg/mL的pPGK1-FAT1-CMV-EGFP线性质粒用于试验时效果较好。玻璃化冷冻解冻4枚EGFP阳性D7囊胚,非手术移植到发情同期化处理的2头受体水牛子宫角,每头移植2枚胚胎,60天后进行直肠孕检发现其中1头受孕。以上结果表明:(1)载体结构为pPGK1-FAT1-CMV-EGFP的质粒通过ICSI-Tr技术可获得了转基因水牛早期胚胎;(2)用线性pPGK1-FAT1-CMV-EGFP质粒DNA进行水牛ICSI转基因的适宜浓度是25μg/mL;(3)ICSI介导的转FAT1基因水牛胚胎移植后可妊娠。
5.探讨了受精早期卵胞质内注射外源DNA生产水牛转基因胚胎的可行性。当向水牛体外受精(IVF)卵胞质内注入7.5pl50μg/mL的线性pEGFP-N1质粒DNA,结果显示,EGFP基因在水牛早期胚胎中得到表达,受精卵卵胞质内注射的早期胚胎基因表达率、囊胚基因表达率与ICSI-Tr无显著差异(P>0.05),且IVF7-10h时注射的分裂率、早期胚胎基因表达率均显著高于18-20h(75.0％比57.5％,P＜0.01;49.0％比26.2％,P＜0.05)。当向去核水牛卵胞质内同时注入pPGK1-FAT1-CMV-EGFP载体DNA与卵丘细胞,结果显示标记基因EGFP能在早期克隆胚胎中得到表达,其分裂率、囊胚发育率均显著低于ICSI-Tr(63.9％比89.2％,P＜0.01;5.6％比18.3％,P＜0.05),但二者间的早期胚胎基因表达率和囊胚基因表达率无显著差异(21.7％比31.3％,P>0.05;50.0％比53.0％,P>0.05)。以上结果表明:(1)水牛IVF受精卵胞质内注射外源基因能获得转基因胚胎,且IVF后7～10h注射的效果优于IVF后18～20h注射;(2)通过向去核水牛卵胞质内共注射外源基因与卵丘细胞能获得转基因水牛胚胎,其转基因效果与ICSI-Tr相当。