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膜翅目昆虫腰带长体茧蜂能成功地寄生亚洲玉米螟幼虫并对寄主昆虫的生长发育产生明显的影响。本研究从亚洲玉米螟及其幼虫寄生蜂腰带长体茧蜂这一寄生体系着手,开展一系列有关酚氧化酶原(PPO)的生理、生化和分子生物学研究,旨在通过对PPO的研究为阐明寄主昆虫与寄生蜂协同进化提供依据,为进一步了解昆虫生命活动的本质做一些有益的探索,主要结果如下:
(1)寄生蜂寄生可明显抑制寄主昆虫体内PPO活性(P<0.01),减少黑色素产生,同时寄主幼虫体内应激产生大量的活性氧自由基(ROS),诱导超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性上升(P<0.01)。在不同组织中SOD、CAT、POD分布存在差异,其中血清中SOD、POD的活性较高,脂肪体内CAT活性最高,体壁组织中SOD、CAT、POD活性均较低。经SDS-PAGE和WesternBlot证明PPO在血清、血细胞和体壁组织中存在,而在脂肪体中未发现PPO。
(2)寄生蜂的萼液成分明显抑制亚洲玉米螟幼虫血清中PPO活性(P<0.05),萼液与毒液混合物对PPO活性有明显抑制作用(P<0.05),注射SephadexG50珠可明显诱导PPO活性(P<0.01)上升。寄生引起亚洲玉米螟幼虫血淋巴中的浆细胞数量显著下降(P<0.01)和粒细胞数量的明显下降(P<0.05),对原血细胞、球形血细胞和类绛色细胞数量没有明显影响(P>0.05)。经FACS检测寄生组FITC标记的血细胞阳性百分率低于未寄生组,差异极显著(P<0.01),注射萼液及萼液与毒液的混合物引起血细胞总数下降(P<0.05),仅注射毒液不会对血细胞总数产生影响(P>0.05),注射SephadexG50珠引起血细胞总数明显上升(P<0.05),未寄生组包囊率明显高于产卵后1天注射组和产卵后8天注射组,随着注射后时间的延长,产卵后1天、8天注射组和未寄生组的包囊率均呈明显上升趋势。
(3)采用硫酸铵分级沉淀、Blue-SepharoseCL-6B亲和层析和Phenyl-SepharoseCL-4B疏水层析等方法,从亚洲玉米螟幼虫血清中分离纯化了酚氧化酶原(PPO)。酚氧化酶原易于自激发且被氯代十六烷基吡啶(CPC)、50﹪甲醇、昆布多糖、胰蛋白酶激活。全酶分子量为158kD,亚基分子量为80kD和78kD,表明该酶由两个不同的亚基组成。纯化的酶可被L-DOPA活性染色,该酶反应的最适pH为7.0,最适温度为25-30℃,以L-DOPA为底物时其Km值为1.6mM,Vmax为4.5μM/mg.protein.s。Ca2+、Mg2+可增强该酶的活性,该酶为糖蛋白,在血细胞中的粒细胞和类绛色细胞膜上产生。
(4)采用1μg/头、0.1μg/头、0.01μg/头三个浓度的保幼激素类似物ZR-515体表点滴和喂饲含有20-羟基蜕皮酮(20-HE)人工饲料的方式处理亚洲玉米螟五龄幼虫,对处理后幼虫的体壁组织、血清和血细胞中酚氧化酶原的活性进行测定,1μg/头ZR-515处理组和0.1μg/头处理组体壁组织中酚氧化酶原活性与未处理组相比有显著提高(P<0.01),血清中的PPO活性也明显上升(P<0.01),以1μg/头处理组PPO活性最高。随处理的亚洲玉米螟幼虫发育时间延长,血细胞溶离物中PPO活性明显升高。经含20-HE人工饲料喂饲过的亚洲玉米螟五龄幼虫同未处理组相比,体壁组织中PPO活性下降(P<0.05),血清和血细胞溶离物中PPO活性低于未处理组(P<0.01)。这些结果表明ZR-515可以诱导亚洲玉米螟五龄幼虫体内PPO活性上升,而20-HE则抑制PPO的合成或激活。
(5)采用RT-PCR方法从亚洲玉米螟幼虫体内扩增了一段长为522个核苷酸的cDNA片段,G+C比率约占52﹪,编码长为174个氨基酸的多肽,经BLAST分析表明该段氨基酸序列与鳞翅目和双翅目昆虫中的酚氧化酶原(PPO)氨基酸序列同源性较高,范围在45﹪-63﹪之间,与烟草天蛾的PPO同源性最高(63﹪),同家蚕、大蜡螟、惜古比天蚕蛾的PPO有较高同源性,在该片段中含有该类酶原中较保守的两个铜离子结合位点中一个(含有四个组氨酸残基)。